糖尿病是以慢性高血糖为特征的代谢性疾病,其发病率逐年上升,日益成为威胁人类健康的重大公共卫生问题。以胰岛移植为代表的β细胞替代治疗在糖尿病治疗方面显示出了巨大的应用前景,但是供体的缺乏限制了其在临床上的大规模运用。获得足够数量的细胞是使其走向临床大规模运用的重要前提,而以多能干细胞分化为胰岛β样细胞的技术路径又存在致瘤的安全风险。寻找其他合适的干/前体细胞可能是解决这些问题的较好选择。研究显示,胆囊上皮存在具有胰腺前体细胞特性的干性细胞,而且这些干性细胞具有向胰岛β细胞方向分化的可能性。然而,现有的细胞分离和培养方法所能获得的干性细胞在数量上都是非常少的,这在很大程度上限制了该领域的研究进展,而且也在很大程度上“朦胧”了以胆囊上皮干性细胞制备胰岛β样细胞的科学设想在转化医学中的潜在意义。为了突破基于胆囊上皮干性细胞向胰岛β样细胞诱导分化体系中的“诱导起始细胞数量有限”这一瓶颈因素,本课题旨在深入认识胆囊与胰腺相互联系的基础上,寻找新的“诱导起始细胞”,并在此基础上发展新的、更为理想的诱导体系,为糖尿病的β细胞替代治疗提供新的思路。为了实现这一目标,本课题从以下几个方面开展了研究:1)探索胆囊与胰腺相互联系:分析以胰十二指肠同源盒1(pancreas duodenal homebox-1,PDX1)、性别决定区框17(sex determining region Y-Box 17,SOX17)、性别决定区框9(sex determining region Y-Box 9,SOX9)和叉头盒蛋白A2(forkhead box protein A2,FOXA2)为代表的胰腺前体细胞特征,以及分别以胰岛素和胰腺淀粉酶为代表的胰腺内、外分泌特征在人原位胆囊上皮的表达情况;2)探索三维培养对于扩增胆囊上皮干性细胞的能力:在无菌条件下,刮取人正常胆囊上皮细胞,包埋入基质胶(matrigel)组成的三维环境中,添加表皮生长因子(epidermal growth factor)、成纤维细胞生成因子10(fibroblast growth factor 10)以及R-脊椎蛋白1(roof plate-specific spondin 1)等生长因子进行培养,评价三维培养扩增胆囊上皮干性细胞的能力;3)探索三维培养胆囊上皮细胞获得的球形克隆的细胞来源:对球形克隆以上皮标志物上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,Ep CAM)和细胞角蛋白19(cytokeratin 19),极性标志物黏蛋白-1(mucin-1)和层黏连蛋白α1(lamininα1)等进行免疫荧光染色和流式分析鉴定,确定球形克隆的细胞起源;4)探索球形克隆细胞干性特征:以包括PDX1、SOX17、FOXA2和SOX9在内的多种胰腺前体细胞标志对球形克隆进行鉴定,了解球形克隆细胞干性表达和分布情况;5)探索球形克隆细胞向胰岛β细胞方向分化的化学诱导方法:基于已有关于胰岛β细胞“胰腺前体细胞—胰腺内分泌前体细胞—胰岛β细胞”发育进程中不同阶段分子表型的认识,将候选的小分子化合物分为对应的三组,分别以PDX1、神经元素3(neurogenin-3,NGN3)和胰岛素的表达高低作为小分子化合物诱导能力的评价指标,筛选出有效的针对不同发育阶段的小分子化合物的组合,为基于球形克隆细胞为“起始细胞”的胰向分化体系的建立准备条件。本课题的研究实现了对胆囊上皮干性细胞基本特性的认识,发现这些干性细胞是比较理想的糖尿病β细胞替代治疗的诱导起始细胞,同时,建立了一个全新的胰向分化的化学诱导体系。在这些进展中,主要的发现有:1)胆囊与胰腺存在紧密的生物学联系,胆囊明显表达胰腺相关特征。在胰腺前体细胞标志物表达方面,胆囊上皮有差异地表达以PDX1、SOX17、FOXA2和SOX9为代表的胰腺前体细胞标志物,且这些标志物在胆囊颈部表达较高,而在胆囊底部表达较少或无表达。而在胰腺内、外分泌相关特征表达方面,胆囊颈部和底部均未见明显胰岛素表达,淀粉酶则见于胆囊底部,胆囊颈部未见明显表达;2)三维培养体系能够支持胆囊上皮细胞生长,并形成大量由较大核质比的单层细胞组成的具有中空结构的球形克隆,这些克隆可以连续传代培养10代以上。而且,三维培养能够获得数量可观的子代细胞,经由连续4周的传代培养可以将细胞数量由起始的10~4数量级提升到10~8数量级;3)球形克隆细胞均表达典型的上皮细胞标志,如Ep CAM和CK19,而以Ep CAM为标志进行流式分析,细胞阳性率为99.98%,表明球形克隆仅来源于胆囊上皮成分。同时,球形克隆细胞呈现极性生长方式,具有明显的顶-基底极性,细胞在朝向克隆中心空腔的一面表达顶端极性标志黏蛋白-1(mucin-1)和蛋白激酶C家族ζ异型体(protein kinase Cζ),而在与基质胶接触的基底面表达层黏连蛋白α1(lamininα1);4)球形克隆细胞分别经RT-PCR在m RNA水平和免疫荧光染色在蛋白水平进行鉴定,这些细胞除表达胰腺前体细胞标志PDX1、SOX17、SOX9和FOXA2外,还表达其他常见的干性标志物,如LGR5、CD133等。另外,在以经典的胰腺干细胞标志乙醛脱氢酶1(acetaldehyde dehydrogenase 1)催化无色荧光底物发光的荧光示踪实验中,绿色荧光均匀分布在整个克隆中,显示出干性细胞标志在球形克隆分布的均一性;5)分别以胰腺前体细胞标志PDX1,胰腺内分泌前体细胞NGN3和胰岛β细胞特有标志胰岛素的表达为评价指标,筛选出了PDX1诱导剂BRD7552、Notch信号通路抑制剂DBZ和以及甲状腺素T3的小分子化合物组合。以该化合物组合处理球形克隆,在m RNA水平上经q PCR验证,与未分化细胞相比,诱导分化后的细胞主要的胰岛β细胞标志的表达均有明显升高:PDX1升高了47倍,同源盒蛋白NKX6.1(NK homeobox factor 6.1)升高了56倍,神经源分化因子1(neuronal differentiation 1)升高了41倍,胰腺内分泌前体标志NGN3升高了139倍,胰岛素升高了185倍。这些结果也在蛋白层面经免疫荧光染色得到了证实。综上所述,本课题的研究证实了人消化系统内的胆囊与胰腺的生物学背景之间存在一种潜在的联系,胆囊上皮干性细胞具有一定相似于胰腺前体细胞的基本特性,是比较理想的糖尿病β细胞替代治疗的诱导起始细胞,而且,胆囊似乎可以视为胰腺前体细胞的“储备池”;证明了体外三维培养可以支持胆囊上皮干性细胞的生长,并能扩增出足够数量的具有胰腺前体细胞特征的胆囊上皮干性细胞;以这种细胞作为胰向诱导分化的起始细胞,建立了基于“PDX1诱导剂BRD7552、Notch信号通路抑制剂DBZ和甲状腺素T3”小分子化合物组合的新的、有效的胰向诱导分化体系。这些结果的取得,在一定程度上明了了胆囊上皮干性细胞潜在的应用前景,也为临床糖尿病的β细胞替代治疗提供了新的思路。