胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES细胞）体外可定向分化为具有典型结构和功能的心肌细胞,该分化体系已成为研究心脏基因表达和功能的重要工具。目前,对ES细胞定向分化为心肌细胞过程中众多基因功能和信号转导网络调控机制尚不十分清楚。虽有一些研究进行了初步探索,但主要集中于一种或少数几种已知基因及蛋白质对心肌细胞终末分化途径的影响。而ES细胞定向分化过程中有众多基因、转录因子、蛋白质和生长因子在不同层面和不同时间调控着心肌细胞分化,若只利用传统基因、蛋白分析方法,难以系统、彻底地阐释整个心脏发育的基本机制。仅从DNA序列尚不能回答某基因的表达时间、表达量、蛋白质翻译后加工和修饰的情况等等,因此在整体水平上研究蛋白质表达及功能变得日益重要。近年来发展起来的蛋白质组学技术是以基因组编码的所有蛋白质为研究对象,从细胞水平及整体水平研究蛋白质的组成及其变化规律,从而深入认识有机体的多种生理和病理过程。其核心技术双向电泳、质谱分析和蛋白质组信息学的迅速发展,可完成极其复杂的蛋白质功能和细胞因子变化的研究。如将其应用于ES细胞体外定向分化为心肌细胞过程的研究,可深入探索心肌分化每一阶段特征性基因转录产物蛋白质的表达及其功能模式,阐明胚胎心脏早期发生与分化的生命现象本质,这对探索干细胞的分化机制和应用有重大意义。泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system,UPS）参与体内许多生命活动,如细胞循环和分裂、分化和发育、神经元网络的形态建成、细胞表面受体或离子通道的调节蛋白质数量控制等。UPS是体内降解蛋白的重要途径,其作用机理为:1)泛素通过共价结合来标记靶标蛋白;2)蛋白酶体对标记蛋白进行降解。C-末端泛素水解酶1（Ubiquitin C-terminal Hydrolase L 1,UCH-L1）的主要作用是将完成任务的泛素-蛋白结合体水解,从而得到泛素单体并重复利用,使体内泛素浓度保持在一定水平,可以认为泛素和UCH-L1的表达呈正相关。有文献表明,泛素可促进ES细胞分化,而阻断蛋白酶体的活性则可使只有在ES细胞分化早期阶段才会活化的基因区域启动转录,说明蛋白酶体对ES细胞的分化有一定抑制作用。另有研究显示核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）启动能促进ES细胞分化,而对蛋白酶体活性阻断会导致NF-κB的作用活性受到抑制,说明蛋白酶体对ES细胞的分化有促进作用。由此可见,UPS在ES细胞分化过程中是一把双刃剑。UCH-L1在神经祖细胞的分化过程中起到极其重要的促进作用。所以,我们推测,UPS系统在ES细胞分化为心肌细胞的过程中同样起着不可忽视的作用。本课题组前期研究已经证实淫羊藿苷（icariin,ICA）介入后显著提高ES细胞体外定向分化为心肌细胞的分化率,并使分化时相显著提前,且有良好的量效和时效关系。并初步探索了ICA能促进心肌发育依赖性基因（如BMP2、GATA4、NKx2.5、α-MHC、MLC-2v和β-AR）和心肌特异性肌小节蛋白（如α-actinin和troponin T）的表达增加,并在时相上呈先后顺序。这提示ICA诱导心肌分化与发育依赖性基因表达上调密切相关。但仅从基因的角度来研究还远远不够,必须研究由基因转录和翻译出蛋白质的过程,才能真正揭示生命现象的本质和规律。目前针对ES细胞定向分化为心肌细胞,尤其是药物诱导分化的蛋白质组学尚未见报道。若能构建药物诱导心肌细胞分化的蛋白质差异表达图谱,可深入探索心肌分化每一阶段特征性基因转录产物蛋白质的表达及其功能模式,对阐明胚胎心脏早期发生与分化的生命现象本质有重大意义,并有利于发现药物作用的新靶点。研究显示,NF-κB与多种心肌分化相关基因表达有关,心肌发育过程中伴随NF-κBp65,p50亚基,IκB亚基表达,其过表达可启动ANF、BNP等胚胎心脏基因重新表达。本实验室前期研究发现,ICA作用EBs后,IκB迅速被磷酸化,其本身迅速降解。继而观察到NF-κB p65核转位增加,提示ICA促心肌分化过程中激活了NF-κB信号。但关于在ES细胞中UPS对NF-κB的作用以及其间ICA所发挥的调控作用尚未见报道。目的:本研究旨在构建ICA诱导小鼠ES细胞体外定向分化为心肌细胞过程中小分子量蛋白质差异表达图谱。并基于鉴定出的差异表达蛋白质,选取UPS系统探索ICA诱导ES细胞体外定向分化为心肌细胞的分化机制。方法:主要采用悬滴培养法,用ICA(10^-7 mol/L)诱导ES细胞体外定向分化为心肌细胞。免疫细胞化学鉴定心肌细胞,以是否出现肌小节判断由ES细胞分化而来的是否是心肌细胞。采用12.5%双向凝胶电泳技术分离小分子蛋白,利用银染染色,扫描后进行图像分析,找出不同分化时相存在明显表达差异的蛋白点,或同一分化时相ICA诱导组和自发分化组有明显表达差异的蛋白点,再用考马斯亮蓝染色后取差异表达蛋白点进行质谱鉴定（MOLDI-TOF-MS）。对鉴定出的蛋白质,采用蛋白质数据库检索（http://mascot.proteomics.com.cn/search-form-PMF.html）,根据搜索结果并结合蛋白质在胶上的等电点和分子量最终确定蛋白质。根据检索蛋白功能（www.expasy.org）将差异表达蛋白分类,并用RT-PCR法,western blot法和免疫荧光化学法进行确证。在鉴定出的差异蛋白中,进一步对UPS在ICA诱导ES细胞分化为心肌细胞过程中的作用进行了初步探索。加入蛋白酶体特异性抑制剂Epoxomicin,观察其对ES细胞向心肌细胞分化率是否有影响,同时检测蛋白酶体活性,用WB法鉴定泛素的表达情况,免疫荧光化学法检测蛋白酶体α2和UCH-L1的表达情况。以此来评价蛋白酶体在ES细胞分化为心肌细胞过程中所起到的作用及论证ICA是否对UPS系统有影响。结果:ES细胞呈集落状贴壁生长,克隆形似鸟窝或岛屿状;集落边缘清晰、光滑,与饲养层界限清楚,无分化迹象;ES细胞排列紧密,细胞之间界限不清。经悬滴培养的ES细胞聚集体,即拟胚体（embryoid body,EB）,呈立体球形。将EB转移到铺有明胶的24孔板内培养,贴壁后继续分化,可观察到搏动的心肌细胞出现。心肌细胞团形状类似球形,有自动节律性收缩中心。经免疫荧光染色,心肌特异性肌小节蛋白辅肌动蛋白（α-actinin）和肌钙蛋白T（troponin T）呈阳性表达。双向电泳结果显示,不同分化时相ICA诱导和自发分化的心肌细胞蛋白质表达图谱存在明显差异。按照ES、EB、自发分化d 5+7心肌细胞、ICA诱导分化d 5+7心肌细胞的顺序,蛋白质数量和表达量整体呈上调趋势。通过质谱共鉴定出52个差异蛋白点,其中上调蛋白点40个,下调蛋白点7个,先下调再上调的蛋白点4个。差异表达的52个蛋白主要可分为细胞周期蛋白,蛋白质合成代谢蛋白,能量代谢蛋白,自身保护蛋白,细胞骨架蛋白,糖代谢蛋白,转录因子等8类。经RT-PCR验证,基因和蛋白的表达趋势存在一定关系。其中,细胞骨架蛋白vimentin和Cap-Z基因在分化全程处于表达状态,而其蛋白表达呈上调趋势,且在分化前期无表达;细胞骨架蛋白MLC-2v基因和蛋白同显示上调趋势,且在心肌中处于高表达状态;转录因子5’-nucleotidase和能量代谢蛋白VDAC2基因各个时期都有表达,并呈上调趋势,而其蛋白在分化期开始表达,并呈上调趋势。WB和免疫荧光验证的结果表明,自身保护蛋白HSPB5在心肌细胞中开始表达,且ICA组比溶剂组的表达量高出许多。在EB中加入蛋白酶体抑制剂Epoxomicin（0.01μmol/L）后,d 5+7由EB分化而来的跳动心肌细胞团数目明显减少,约比溶剂DMSO对照组减少到45%,而在ICA与Epoxomicin合用时,跳动心肌细胞团数目较Epoxomicin组有所回升,但无统计学差异。说明蛋白酶体在ES细胞定向分化为心肌细胞的过程中,起到了重要作用,且ICA对于UPS的正常功能有保护作用。在测定蛋白酶体活性实验中,ICA组的蛋白酶体活性高于DMSO组,ICA+E（抑制剂）组的蛋白酶体活性明显高于E组。泛素的蛋白表达与蛋白酶体活性相吻合,蛋白酶体活性低的组别中泛素连接蛋白表达量明显大于蛋白酶体活性高的组别,说明由于蛋白酶体活性的下降,导致泛素降解为单体的过程严重受阻。结论:1.通过蛋白质双向电泳技术构建了ICA诱导ES细胞定向分化为心肌细胞的蛋白质差异表达图谱,通过质谱共鉴定出52个差异蛋白点,主要可分为细胞周期蛋白,蛋白质合成代谢蛋白,能量代谢蛋白,自身保护蛋白,细胞骨架蛋白,糖代谢蛋白,转录因子等8类。2.UPS在ES细胞定向分化为心肌细胞的过程中,起到了重要作用。蛋白酶体活性的阻断能导致ES细胞定向分化为心肌细胞的分化率明显下降,ICA诱导心肌细胞分化机制与UPS蛋白表达和活性升高有关,能一定程度逆转蛋白酶体抑制剂Epoxomicin对NF-κB激活的抑制作用。