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研究背景:胃癌(gastric cancer)是消化道常见恶性肿瘤,是发生率世界排名第五位的癌症,其死亡率高达75%,因此探索胃癌的发生、发展机制有非常重要的意义。胃癌的发生发展与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染密切相关,其致病机制也是现在的研究热点。TNF-α诱导蛋白(TNF-α-inducing protein,Tipα)是H.pylori特异性的分泌蛋白,被认为是胃癌发展相关的新的致癌因子。新近研究表明,Tipα能够通过诱导胃黏膜上皮细胞炎症反应、上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)等参与H.pylori致病过程,但其诱导EMT形成的机制仍不清楚,它所涉及的细胞通路也有待进一步研究。因此研究Tipα对胃癌细胞EMT形成的影响及其相关作用机制,可能为胃癌的临床诊断及靶向治疗提供新的靶点。研究目的:通过H.pylori Tipα处理胃癌细胞系SGC7901细胞,研究Tipα对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学功能影响,探究TGF-β1/Smad信号通路在其中的作用。研究方法:(1)将含Tipα原核表达载体的大肠杆菌扩大培养,用IPTG进行诱导后,用亲和层析纯化得到大量Tipα蛋白,进一步对该蛋白去内毒素、Western blot鉴定,并测定其浓度;(2)Tipα刺激处理SGC7901细胞,显微镜下观察其形态学变化,通过细胞增殖实验(CCK8法)、流式细胞术分别检测其对细胞增殖和凋亡的影响;(3)ELISA方法分别检测不同浓度Tipα处理SGC7901细胞不同时间对TGF-β1分泌水平的影响;采用TGF-β受体抑制剂LY2109761阻断TGF-β1/Smad信号通路后,q RT-PCR法检测比较EMT相关标志物E-cadherin和α-SMA以及通路相关TGF-β1的m RNA的表达变化,Western blot检测E-cadherin和α-SMA以及通路相关TGF-β1、Smad3、p Smad3的蛋白表达变化;(4)阻断TGF-β1/Smad信号通路后,划痕愈合实验分析Tipα对细胞迁移能力的影响,q RT-PCR法和Western blot法分别检测侵袭相关基质金属蛋白酶MMP9 m RNA和蛋白的表达变化。研究结果:(1)Tipα蛋白刺激SGC7901细胞12h后,显微镜下可观察到SGC7901细胞从椭圆扁平状向梭形改变,同时细胞间变得相对松散,并有伪足出现;(2)Tipα刺激能增强SGC7901细胞的增殖,抑制细胞凋亡;(3)Tipα诱导SGC7901细胞分泌TGF-β1水平增高(以100μg/m L Tipα刺激12h增高最显著),E-cadherin表达下降,α-SMA表达增高;阻断TGF-β1/Smad信号通路后,E-cadherin表达增加,α-SMA表达减少,TGF-β1和Smad3表达无明显差异,p Smad3表达增加;(4)Tipα刺激能增强SGC7901细胞的迁移能力及侵袭相关蛋白MMP9的表达,阻断TGF-β1/Smad信号通路后,细胞的迁移和侵袭能力明显受抑制。研究结论:(1)Tipα能促进SGC7901细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制细胞凋亡;(2)TGF-β1/Smad信号通路参与H.pylori Tipα诱导的胃癌细胞EMT形成。