研究背景角膜盲是严重影响患者的生存质量和身心健康的疾病。角膜移植手术是协助这些患者复明的重要手段。然而,尽管角膜移植手术目前是人体内成功率最高的移植手术之一,然而手术后的排斥反应仍然是威胁到治疗效果的首要原因。角膜移植排斥反应是一个复杂的免疫反应过程,免疫系统中多种成分参与到排斥反应。尽管目前针对角膜移植排斥反应机制的研究已日趋成熟,临床上也有诸多预防移植排斥反应的药物干预手段,但是角膜移植排斥反应依然未能完全避免。因此,进一步探索和明确角膜移植排斥反应的发生机制,寻找抑制排斥反应的发生、发展的有效途径,仍需进一步研究。迄今为止,角膜移植排斥反应的免疫机制已有较为广泛的研究。角膜移植已经发展为较成熟的移植手术,已在临床上成功实施约100年。因为角膜局部免疫赦免的存在,角膜移植成功率高居首位。免疫赦免的定义是：角膜植片发生排斥反应的机会较少、发生排斥反应的速度和进展较为缓慢。研究发现的排斥反应发生机制主要有以下两个方面：(1)角膜缘局部含有大量携带HLA-DR (Human leucocyte antigen)抗原的朗格汉斯细胞,这可以诱发早期角膜移植排斥反应的发生,促进移植排斥反应的进展。(2)角膜局部的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)和次要抗原分子都参与到角膜移植排斥反应的过程当中,APCs吞噬和摄取外来入侵抗原并行处理之后,由MHC-II类分子表达于细胞的表面,和T细胞表面的TCR形成共刺激分子诱导T细胞识别、区分“异已”成分。急性角膜移植排斥反应是由CD4+T细胞为主导的Ⅳ型超敏反应。反应发生后,即可启动一系列免疫炎症细胞的释放,对角膜植片造成无可挽回的损伤和破坏,最终导致移植手术的失败。目前,临床上针对角膜移植排斥反应的预防和治疗,主要采用以下几种方法：1、对因治疗：抗排斥反应；2、预防和控制术后感染,减少术前高危因素；3、对症支持治疗,改善营养支持。而临床用药抗排斥反应又是所有治疗手段中最常采用和最有效的。目前最常用的药物主要是：糖皮质激素、免疫抑制药物例如环孢素A、白细胞介素-1受体拮抗剂、FK506、抗肿瘤药物等进行治疗。但是这些药物的应用仍然具有一定的副作用。糖皮质激素在人体的长期应用可能会抑制机体免疫功能从而引起感染等症状;环孢素A的副作用较糖皮质激素要轻,但是可增加发生恶性肿瘤特别是皮肤癌的风险。白细胞介素-1受体抑制剂虽然可以通过抑制炎症因子的表达降低APCs的趋化作用,但是长期应用会引起剂量依赖性：FK506属于真菌的代谢产物,作用机制和CsA类似,但是因为成本太高,临床应用仍受到限制。因此,进一步明确角膜移植排斥反的免疫学机制,寻找新的阻断靶点,研制开发出新型的、副作用更小且更有效的药物,将是临床和科研工作者当下极其重要的任务。TLRs (Toll like receptors)是可识别侵入机体的病原体相关分子模式(PAMPs, Pathogen Associated Molecular Patterns)以及损伤相关分子模式(DAMPs, Damage Associated Molecular Patterns)的膜结合蛋白,在免疫系统中占据了重要的地位。截至目前为止,科学家已发现13种TLRS。其中,Toll样受体2(TLR2, Toll like receptor 2)作为所有TLRs中表达范围最广、识别病原微生物和其产物种类最多的蛋白。在炎症发生以后,机体炎症灶和受损器官组织内的外源性配体(如脂蛋白、肽聚糖、脂磷壁酸等)、内源性配体(透明质酸、热休克蛋白70以及高迁移率族蛋白B1等)可以迅速增加,TLR2可以作为天然免疫系统中的重要分子,通过识别结合以上配体,开启机体免疫反应模式。这一作用也让TLR2成为联结天然免疫和固有免疫的重要纽带。科学家对TLRs家族多年的研究,已确认TLRs至少有MyD88依赖性和MyD88非依赖性两条信号途径启动下游通路。目前已经有大量研究发现,TLR2本身主要通过MyD88依赖性途径启动下游信号转导通路,参与移植相关的免疫排斥反应过程。研究显示在肝、肺、肾、胰等实质性器官移植排斥反应的标本中,TLR2和MyD88表达均较正常标本显著升高；有学者发现通过应用激素、环孢素-A、抗体和特异性阻滞剂可阻断TLR2-MyD88信号途径,有效延长移植物的存活时间；另外,TLR2基因敲除的小鼠模型的移植物组织中,炎症细胞浸润程度均较轻,生存时间和较野生型相比显著延长。我们的前期研究工作也显示TLR2和MyD88在大鼠的穿透性角膜移植(penetrating keratoplasty, PKP)排斥反应模型中表达显著增高,应用糖皮质激素和TLR2单克隆抗体(TLR2 monoclonal antibody, TLR2 mAb)处理大鼠PKP动物模型可以下调植片TLR2-MyD88的表达,抑制了角膜移植排斥反应的发生和发展,从而延长了植片的存活时间。由此可见,TLR2-MyD88信号通路参与了移植免疫排斥反应过程。在角膜移植的排斥反应过程中,TLR2/MyD88信号系统也发挥了关键作用。基因沉默是基因治疗中的一种常见手段,通过针对特定基因,抑制、阻止其的表达,从而达到治疗疾病的目的。RNAi (RNA interference)是基因沉默手段中的常见方法之一,主要通过向细胞内引入小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)等小片段RNA,诱发宿主细胞内和siRNA片段对应的mRNA特异性降解,高效抑制相关基因的表达,即基因沉默效应。目前以慢病毒(Lentiviral vector,LV)为载体构造的siRNA已在眼科研究领域广泛应用。已有研究显示慢病毒载体介导基因转染角膜可达到长期、有效和稳定的表达。另外,慢病毒载体转染对细胞和组织未产生明显毒性。以上这些优势,都让慢病毒成为未来用于角膜疾病基因治疗极具潜力的载体。本实验拟构建LV介导的TLR2-siRNA携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)的载体,先进行功能鉴定和滴度测定,随后展开以下研究。体外实验：(1)利用LV-TLR2-siRNA-EGFP基因转染原代培养的角膜上皮细胞和角膜基质细胞,分析LV-TLR2-siRNA-EGFP转染后细胞中TLR2蛋白的表达情况对角膜上皮和基质细胞的影响；体内实验：(2)应用LV-TLR2-siRNA-EGFP于PKP术后大鼠受体,通过裂隙灯观察及排斥反应指数评价角膜植片的转归,进一步行病理学检测,并用RT-PCR技术和免疫组化技术分别在mRNA和细胞分子水平检测角膜TLR2和下游信号分子MyD88的表达。这为我们进一步探索以TLR2为基因治疗靶点防治排斥反应的可行性,为该通路在角膜移植排斥反应的预防和治疗方面的临床转化研究提供实验依据。第一部分慢病毒载体介导TLR2基因沉默对大鼠角膜上皮细胞和角基质细胞影响的实验研究目的观察慢病毒介导TLR2-siRNA基因转染大鼠角膜上皮细胞和基质细胞的基因沉默有效性和生物安全性。方法无菌条件下取下大鼠眼球,剪下大鼠角膜组织,分离出角膜上皮层与基质层,分别以无菌PBS洗涤2-3次,各加入1mL胰蛋白酶,消化30min。放入含有DMEM的培养基中,置于37℃和含体积分数5% C02的细胞培养箱中培养。两种细胞各分为3组：转染组以LV-TLR2-siRNA-EGFP进行转染；空白对照组加入空白培养液,阴性对照组加入不携带目的基因干扰序列的LV。转染组按最佳感染复数(Multiplicity of infection, MOI)分别为10,50,100,200加入LV-TLR2-siRNA-EGFP,荧光显微镜下观察选择EGFP表达最强的MOI。光学显微镜下观察转染组细胞形态变化情况；以CCK-8检测细胞增殖情况,分别于转染后0h、72h和96h以酶标仪490nm检测转染细胞的OD值。两种原代角膜细胞分别以LV-TLR2-siRNA-EGFP转染96h后取出,用胰蛋白酶消化后进一步离心,加入PBS液制成细胞悬液。利用流式细胞仪检测正常细胞及转染细胞的荧光表达量,评估转染效率。参照DBI公司说明书配制成PCR反应液进行实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR, qPCR)检测。cDNA扩增条件：94℃2mi; 94℃30s,58℃30s,72℃ 20s,40个循环,用ABI 9700 PCR仪进行RT-PCR实验,检测各组细胞TLR2 mRNA的表达。结果在设置的各转染复数中,MOI为200时转染组角膜上皮和基质细胞荧光表达强度在为最高,此时转染后的两组原代培养的角膜细胞分别与空白对照组相比,细胞形态均未发生明显肿胀、形态显著改变等病理变化；CCK-8结果显示转染组和空白对照组、阴性对照组比较,随时间变化各组OD值比较均无统计学意义(均为P>0.05)；流式细胞仪检测角膜上皮和角膜基质细胞,转染效率分别为77.600%±1.100%和76.300%±1.387%。RT-PCR检测转染后角膜上皮和基质细胞TLR2 mRNA相对表达量均较对照组明显下降,差异均有显著的统计学意义(均为P<0.001)。结论LV-TLR2-siRNA-EGFP可在体外稳定有效转染角膜上皮和角膜基质细胞,且对细胞增殖无显著影响,并可有效下调TLR2 mRNA的表达,实现基因沉默的功能。第二部分慢病毒介导TLR2基因沉默抑制大鼠角膜移植术后排斥反应的实验研究目的观察LV-TLR2-siRNA-EGFP对同种异体大鼠角膜移植术后排斥反应发挥的作用,探讨TLR2基因沉默抑制角膜移植移植排斥反应的可行性。方法实验分5组：正常组(N)、同种异体角膜移植组(A)、同种异体角膜移植空载体组(B)、同种异体角膜移植LV-TLR2-siRNA-EGFP给药组(L)、同种自体角膜移植组(I)。A、B、L组大鼠分别行同种异体穿透性角膜移植手术,I组行同种自体PKP。L组于术后给予结膜下注射20μL LV-TLR2-siRNA-EGFP,A和B组大鼠术后分别给予等量生理盐水和LV-EGFP空载体处理。术后每日于裂隙灯显微镜下观察各组大鼠的角膜植片,对水肿、浑浊程度、新生血管生长情况进行评估,根据Holland评分标准对植片进行排斥反应指数评分,由2人分别计数取平均值,记录每组大鼠角膜植片发生排斥反应的天数,其后行生存分析。于术后第9天取各组大鼠眼球,进行石蜡包埋后,进行HE染色。电子显微镜下观察各层角膜组织的结构,比较各组间切片病理组织情况的差异。同时对各组大鼠角膜植片里的TLR2和MyD88进行免疫组化染色。观察各组染色细胞数目差异。另外,以正常大鼠角膜为对照,取移植术后9天、14天各组大鼠角膜植片组织行实时荧光定量PCR,检测角膜中TLR2、MyD88 mRNA的表达情况。结果1、术后各组植片水肿、混浊、新生血管均随时间变化逐渐加重。术后第9天,A组和B组均呈现出较重的水肿和基质增厚,新生血管长至植片边缘；与此同时,和A、B组相比,L组和I组植片的水肿、浑浊和新生血管生长情况均较轻。2、HE染色结果显示：正常大鼠角膜组织分5层,各层结构排列规则,基质层无水肿和炎症细胞浸润。术后第9天,A、B组角膜基质层明显增厚,结构排列紊乱,炎症细胞浸润明显。在L和I组,基质层未明显增厚,结构排列规则,仅见少量炎症细胞。3、免疫组化结果显示：正常大鼠角膜中可有少量TLR2、MyD88蛋白表达,术后第9天,A、B组TLR2、MyD88分子表达量明显增加,而L组中表达TLR2、MyD88染色的阳性细胞数明显较A、B组要少。4、术后第9天和第14天,实时荧光定量PCR在各组中均可检测到TLR2和MyD88 mRNA的表达。第9天结果：A组(15.350±1.562；4.113±0.572)、B组(13.848±1.475；3.646±0.227)、L组(8.825±1.333；2.416±0.479)、Ⅰ组(3.67±0.529；1.252±0.249)。A、B组TLR2和MyD88 mRNA相对表达量均显著升高,Ⅰ组、L组表达较A、B组明显降低。第14天Ⅰ组(5.153±0.256；2.504±0.057)和L组(5.269±0.251；2.628±0.146)表达量仍显著低于A(12.104±0.430；3.581±0.107)、B(10.567±0.277；3.192±0.193)两组。TLR2和MyD88 mRNA呈现出一致的变化趋势5、所有手术组大鼠角膜植片中位生存时间：A组和B组分别为9d和10d,L组在30d时有半数以上存活,生存曲线组间比较具有统计学意义(p<0.001；p<0.001)。结论LV-TLR2-siRNA-EGFP通过下调TLR2及其下游信号分子MyD88的表达,有效延长了大鼠同种异体角膜移植植片的术后生存时间；TLR2MyD88信号系统参与了角膜移植术后排斥反应,在移植排斥反中占据重要的地位。