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干扰素-α(interferon-α)和干扰素-β(interferon-β)属于Ⅰ型干扰素,分别由活化的白细胞和成纤维细胞产生,具有广谱的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性;干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)为Ⅱ型干扰素,主要由活化的T淋巴细胞和NK细胞产生,丝裂原以及抗原特异性刺激T淋巴细胞克隆也可产生,它具有广泛抗病毒、抗细胞内寄生菌及胞内寄生虫、抗肿瘤和免疫调节作用,在机体免疫系统中发挥重要作用。由于Ⅰ型、Ⅱ型干扰素在疾病的诊断、治疗、预防和疫苗免疫效果检测等方面均具有重要作用,因此它是现代分子生物学、免疫学和临床医学研究的热点之一。本研究通过RT-PCR技术克隆了牦牛干扰素-γ基因,并构建了原核表达质粒pET-30a-yakIFN-γ,用IPTG诱导表达并对其最佳诱导表达条件进行探索。结果表明:克隆的yakIFN-γ基因序列与GenBank上登录的牛IFN-γ基因序列的同源性为99%;表达的最佳条件为:在LB培养基中28℃诱导5h,诱导剂浓度为0.5mmol/L。然后用镍柱对可溶性表达产物进行亲和层析纯化,包涵体经DOC洗涤、SKL变性溶解、透析复性进行纯化;可溶性表达产物纯化后用SDS-PAGE、Western-blot分析证实得到了高纯度的重组yakIFN-γ。在对牦牛干扰素-?(yakIFN-α-A/Ⅱ和yakIFN-β)基因进行改造后,选用近年来发展最快和最具潜能的真核表达系统-毕赤酵母对这三个基因进行表达。首先分别构建了这三个Ⅰ型干扰素基因的重组表达载体pPIC9K-yakIFN-Ⅰ(pPIC9K-yakIFN-α-A、pPIC9K-yakIFN-α-Ⅱ和pPIC9K-yakIFN-β)用SalⅠ内切酶线性化,电转化毕赤酵母菌种GS115,使重组表达载体与宿主酵母染色体发生同源整合,并用G418抗性梯度筛选法,获得多拷贝重组菌株。对重组菌株利用甲醇进行诱导分泌表达,用SDS-PAGE分析表达情况,发现重组菌株分泌表达在72h时达高峰,分泌量可达180mg/L左右。对纯化的yakIFN-γ和yakIFN-Ⅰ(yakIFN-α-A、yakIFN-α-Ⅱ和yakIFN-β)重组蛋白的生物学活性研究表明:重组牦牛IFN有诱导刺激淋巴细胞增殖能力,其中yakIFN-γ诱导刺激能力比yakIFN-Ⅰ强;用yakIFN-γ和yakIFN-Ⅰ抗PRV生物活性研究发现,yakIFN-Ⅰ的抗病毒活性比yakIFN-γ强,同时yakIFN-α-A和yakIFN-β联合使用比单独使用抗PRV病毒活性强2倍,yakIFN-γ和yakIFN-β联合使用比单独使用yakIFN-γ抗PRV的活性强4倍。由此表明,本研究表达的yakIFN-γ、yakIFN-α-A、yakIFN-α-Ⅱ和yakIFN-β重组蛋白具有较高的、广泛的生物学活性,可以开发利用。我国是牦牛主产国,本研究为牦牛IFN (yakIFN)基因工程生物制品的进一步开发和相关疾病的治疗或预防奠定了基础。