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克百威(carbofuran，CBF)，属于氨基甲酸酯类杀虫剂，因其属高毒杀虫剂，对人、畜禽、鱼、鸟等毒性极高，具有触杀和胃毒作用，且难降解，易造成环境污染，国家农药残留标准中已明确规定其在水果和蔬菜中不得检出。但目前违禁使用现象仍较为严重，违规使用CBF导致的食品安全问题时有发生，危害严重。免疫分析法快速、简便、灵敏，特异性好，在食品安全快速及大批量的筛查分析中优势突出。相比多克隆抗体及单克隆抗体，周期短、成本低的基因工程单链抗体(Single chain Fvantibody，scFv)已经成为免疫分析研究中新的热点。在本实验室之前的工作中，已通过噬菌体抗体库技术获得了抗克百威的单链抗体(CBF scFv)基因，构建融合碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AP)表达载体，并以单链抗体融合碱性磷酸酶的形式(scFv-AP)形式在大肠杆菌BL21实现表达。但研究中却发现其亲和力较低的问题。针对以上问题，本论文在前期研究的基础上，从基因序列出发，获得抗体蛋白序列，通过计算机模拟分析，并配合定点突变技术对scFv序列进行改造，以获得亲和力更高的CBF scFv，主要研究内容及结果如下： (1)CBF scFv与CBF的分子对接分析 转换CBF scFv基因序列为蛋白序列，利用同源模建技术构建CBF scFv的三维模型，确立由HLys38～HTrp50，LGln37～LGlu42，LAla84-LLeu89，LThr97～LLeu104四组氨基酸围绕而成的结合活性口袋，同时利用分子对接技术，分析CBF scFv与CBF的对接结果，发现活性口袋内氨基酸疏水性及氢键作用是影响抗体与药物分子相互结合的关键因素，进一步分析分子对接结果发现疏水性及氢键作用决定了抗体与药物分子结合的强弱，由此推测将活性口袋内的亲水氨基酸替换成疏水氨基酸可能提高抗体的亲和力。 (2)CBF scFv分子进化的理性设计 在得到抗体活性口袋的基础上，对其中的氨基酸残基进行分析，在不改变疏水性较大的氨基酸残基及与药物分子形成氢键的氨基酸的前提下，同时考虑氨基酸残基是否在活性口袋与药物分子结合的中心区域，最终确定HArg40，LHis38，LLys103为突变位点。同时选择疏水性最高的异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸为突变氨基酸对以上三个位点处的氨基酸进行替换，利用同源模建技术获得21个突变抗体的三维模型，分子对接分析发现，将HArg40，LHis38替换成HLeu40，LLeu38，而LLys103不进行突变的情况下获得的分子对接得分高于原抗体的分子对接得分。分析药物分子与该突变抗体的对接结果，发现药物分子的结合仍在活性口袋的中心位置，且药物分子与活性口袋内的氨基酸残基比原抗体多形成一个氢键，这提示我们将HArg40，LHis38替换成HLeu40，LLeu38可能提高抗体亲和力。 (3)进化后单链抗体(CBF-evo scFv)的基因构建、表达及鉴定 根据理性设计结果，对CBF scFv基因序列进行改造，通过引物设计引入突变，扩增各突变片段的基因序列，并通过重叠延伸拼接扩增获取全长的CBF-evo scFv序列，构建重组表达质粒pLIP6/GN-CBF-evo，转化大肠杆菌表达菌株BL21，经IPTG及低温诱导条件的优化，诱导分泌表达，产物进行SDS-PAGE电泳鉴定和Western-blot鉴定。结果显示目标蛋白分子量为78 kDa，且可被鼠抗碱性磷酸酶单克隆抗体特异性识别。直接竞争ELISA分析检测CBF-evo scFv的免疫活性，结果显示为CBF-evoscFv能识别CBF-OVA抗原，对CBF药物有抑制作用，(IC50)为18.11 ng/mL，低于CBF scFv的27.25 ng/mL，用非竞争ELISA法测得亲和力常数Ka值为2.46×107L/mol，比CBF scFv提高了约3.23倍。