研究背景烟曲霉是目前世界上导致患者死亡最常见的真菌,广泛存在于自然界,尤其是土壤、腐败的蔬果及建筑垃圾中,在秋冬及阴雨季节,贮藏的谷草发生霉变时更多。吸入曲霉孢子不一定致病,如大量吸入或慢性病人免疫力严重低下时才可能引起侵袭性肺曲霉病(Invasive pulmonary aspergillosis,PA)。IPA是一种继发于免疫功能低下的严重机会性感染疾病,多见于粒细胞缺乏、大剂量激素及免疫抑制剂应用、器官移植和AIDS等免疫抑制患者。IPA因其临床表现多样,诊断困难,疗效不佳,因而预后较差,病死率高。近年来研究表明,IPA的发病率呈上升趋势,且病死率居高不下,研究表明从1989年到2003年,恶性血液病患者IPA的发生率从0.9%增加到2.9%,死亡率增加到79.2%-82.0%。microRNAs(miRNAs)是一类广泛存在于各种真核生物中大小约19-25核苷酸的单链非编码小分子RNA,其表达具有组织特异性和时序特异性。miRNA加工成熟后,通过与靶mRNA3’端非翻译区(Untranslated region, UTR)的序列不完全互补或完全互补,导致靶mRNA的翻译抑制或降解,从而在转录后水平负性调控靶基因的表达。miRNA在细胞增殖、个体发育、细胞凋亡和癌症发生等过程中发挥着重要调控作。研究发现,miR-155(miRNA-155)的产生可以介导早期的促炎反应。let-7i和miR-125b能降低早期的免疫反应。miR-146在反应后期表达,是重要的负性调节免疫反应的因子,可以负反馈关闭Toll样受体(Toll-like receptors, TLR)通路。miR-21提高抗炎反应,促进IL-10产生,而IL-10对miR-155的抑制作用能进一步引起抗炎反应。目前,国内外已有细菌、病毒、白念珠菌感染后miRNA调控巨噬细胞炎症反应的研究,发现在该类感染中miRNA能负性调控促炎因子产生,维持免疫平衡。迄今为止,国内、国际关于烟曲霉感染后miRNA是否参与调控并不清楚。因此,本研究通过动物模型筛选出参与烟曲霉感染调控的肺部烟曲霉感染相关的miRNA,对阐明烟曲霉感染的发病机制有重要意义。本课题应用高通量深度测序(HiSeq deep sequencing)的方法,对免疫缺陷的IPA小鼠组织和配对的免疫缺陷非IPA小鼠肺组织进行检测,参照Genebank和miRBase数据库,筛选IPA小鼠肺组织中差异表达的miRNA(差异表达miRNA的定义为：Fold-change>1或者Fold-change<-1,并且p<0.05),构建IPA小鼠肺组织差异miRNA表达谱,探讨它们在小鼠IPA感染发生中的表达变化规律；应用Real-time PCR方法,扩大样本量,检测高通量筛选出且大于2倍的miRNAs在免疫缺陷的IPA小鼠肺组织和配对的免疫缺陷非IPA小鼠肺组织中的表达情况,对测序数据的可靠性和准确性进行验证；针对验证的miRNAs,运用靶基因预测软件预测其靶位点,初步探讨IPA中显著差异表达的miRNAs的靶标。研究目的：1通过经气管插管的方法滴入烟曲霉孢子悬液建立IPA感染的小鼠模型,动态观察其肺组织病理改变,以期为IPA研究提供在体模型及观察IPA疾病发展过程。2通过新一代高通量测序技术HiSeq deep sequencing测序和生物信息学的技术分析方法,对免疫缺陷IPA小鼠肺组织miRNAs的组学进行系统性分析,筛选出差异表达的miRNAs,构建其miRNA的表达谱。3鉴定差异表达的miRNA,验证筛选数据的准确性及可靠性。4针对鉴定的miRNA,通过靶基因预测软件进行靶位点确认,通过对靶位点所在基因的GO功能注释以及KEGG pathway注释,初步探讨调控IPA的靶标,为研究IPA调控机制奠定基础。研究方法：1.免疫缺陷的IPA小鼠感染模型的建立：1.1免疫缺陷小鼠模型的构建：C57BL/6J小鼠经腹腔注射环磷酰胺250mg/kg X2次构建免疫抑制状态,眶后静脉丛取血行中性粒细胞计数。1.2IPA小鼠模型构建：麻醉状态下于小鼠颈部切开一0.3cm小口,分离出气管并接种25μl烟曲霉临床株悬液8×106/只或PBS25μl/只；动态观察小鼠一般情况、生存率、肺部真菌负荷、肺组织大体及苏木精-伊红染色(Hematoxylin and Eosin stain,H&E)。肺组织真菌负荷的检测采用Real-time PCR测量烟曲霉18s rRNA方法,用标准曲线定量烟曲霉孢子。2高通量测序及其生物信息学分析IPA小鼠肺组织miRNA方法：2.1样品收集：分别收集3只感染第3d的免疫缺陷IPA小鼠肺组织(分别标记为25-3d、26-3d和27-3d)和3只免疫缺陷的非IPA小鼠的肺组织(标记为25-0d、26-0d和27-0d)。2.2Total RNA提取和鉴定：分别提取各个样本的Total RNA,运用核酸测量仪检测其浓度及纯度,15%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其质量。其中3个0d的小鼠肺组织样品total RNA等量混匀后成一份样本标记为1-Od,而3个3d的小鼠肺组织样品total RNA单独提取。2.3cDNA文库的构建：样品提取total RNA后,回收18-30nt大小的片段。应用T4RNA连接酶,在片段两端加入5’及3’端测序接头。以加入接头后的片段为模板,用六碱基随机引物合成cDNA,后续加入5’端接头引物和3’端接头引物进行PCR扩增,从而完成整个文库的制备工作。2.4HiSeq deep sequencing测序：采用边合成边测序(SBS-sequencing by synthesis)的方法,减少因二级结构造成的一段区域的缺失。其优点是可以一次性获得数百万条小分子RNA序列,可以快速全面地鉴定免疫缺陷IPA小鼠肺组织的小分子RNA并发现新的小RNA,从而构建样品之间的小RNA差异表达谱。2.5信息分析：HiSeq测序所得50nt序列,通过去接头、去低质量、去污染等过程完成数据处理得到high quality tags,对其进行序列长度分布的统计及样品间公共序列统计。将清理后的high quality tags分类注释,获得样品中包含的各组分及表达量信息。2.6已知miRNA的鉴定和新miRNA预测：所有小RNA片段注释后,用SOAP软件将剩下的未注释片段来进行已知miRNA和novel miRNA的预测。3免疫缺陷IPA小鼠肺组织miRNAs表达谱分析及鉴定：3.1miRNA差异表达分析：根据HiSeq测序结果,统计3个免疫缺陷IPA小鼠肺组织miRNA的表达量,分别设为实验组,然后都以0d为参照,同时参考log2-rati、Scatter plot图,比较3组样品中共同差异表达的miRNA。3.2miRNAs的鉴定：用Real-time PCR方法,检测筛选出大于2倍的miRNAs在免疫缺陷的IPA小鼠肺组织和免疫缺陷的非IPA小鼠肺组织中的表达情况,对测序数据的可靠性和准确性进行验证。4靶基因预测：针对已经鉴定的miRNA,通过RNAhybrid靶基因预测软件预测其靶位点,然后通过对靶位点所在基因的GO功能注释以及KEGG pathway注释,初步探讨调控IPA的靶标。研究结果：1环磷酰胺注射液250mg/kg于感染前第3d及第1d对C57BL/6J小鼠腹腔注射,发现外周血中性粒细胞明显减少。感染当天到第4d,中性粒细胞数均持续低于100/ul,与正常组相比IPA组及PBS组中性粒细胞减少差异有统计学意义(P<0.05),中性粒细胞减少达到免疫缺陷标准。2经腹腔麻醉小鼠后,气管切开注入烟曲霉孢子悬液,随着时间的迁延,小鼠喘息逐渐加重,活动度逐渐减少,体质明显减弱;小鼠感染烟曲霉后第4d死亡率为100%；感染后第1d肺部曲霉孢子含量最高,后逐渐降低;肺组织大体表现为出血、水肿、及白色菌团结节,呈逐渐加重趋势；病理发现肺泡内炎症细胞渗出,肺组织大量出血、坏死,随时间延长而加重,最终正常肺泡结构消失。3应用HiSeq deep sequencing(高通量深度测序)的方法,分析了3对免疫缺陷IPA小鼠肺组织和配对的免疫缺陷的非IPA小鼠肺组织miRNA的表达情况,结合数据分析,我们对这些差异的miRNA在IPA中的表达变化规律进行了总结分析,结果显示：显著性差异表达的miRNA有23个,其中有14个miRNA表达下调,9个miRNA表达上调,提示这些miRNA可能与IPA的发生密切相关。其中有8个miRNA差异表达大于2倍,分别是6个上调的miRNA (mmu-let-7b-3p、mmu-miR124-3p、mmu-miR21a-3p、 mmu-miR29c-5p、mmu-miR3473b和mmu-miR3473e)和2个下调的miRNA (mmu-miR-150-3p和mmu-miR-503-5p)。试验中发现：3对免疫缺陷IPA小鼠肺组织和配对的免疫缺陷的非IPA小鼠肺组织中有2个显著性差异表达新miRNA (Novel-miR-2:AATGTGGAAGTGGTCTGAGGCAT和Novel-miR-3:CCGGGCGGGCGGGCGAGCGG)未在miRBase数据库中注册。4通过扩大样本量(IPA=20,control=20)对上述8个表达差异大于2倍的miRNA进行Real-time PCR方法验证,发现8个差异表达的miRNA均有统计学意义(p<0.05)。表达情况与测序结果相符,可见,测序数据是可信的。5通过对验证基础上的8个miRNA靶基因预测,我们发现：不同的miRNA,其预测的靶基因数目不一样,有可能数量上千,也有可能为零；通过KEGG通路分析,发现在3组IPA小鼠肺组织中,Cysteine and methionine metabolism signaling pathway, Sulfur metabolism signaling pathway和Carbon fixation in photosynthetic organisms pathways in cancer信号通路靶基因参与的最多。在IPA的发生发展中,miRNA的调控不尽相同,他们的表达机制也不同,可能以某个miRNA为主,多种miRNA为辅。研究结论：1环磷酰胺腹腔注射构建免疫缺陷状态后,经气管切开滴入烟曲霉孢子悬液能够建立符合IPA典型病理改变的免疫缺陷小鼠模型,过度炎症反应是动物死亡的重要原因,为进一步治疗及预防IPA发生和发展的研究提供了基础。2我们通过对同一批免疫缺陷IPA小鼠肺组织和配对的免疫缺陷非IPA小鼠肺组织样本中显著差异的miRNA表达谱的研究及靶基因预测分析,初步揭示了miRNA差异表达在IPA中表达变化规律,其中差异大于2倍的表达上调的miRNA有：mmu-let-7b-3p、mmu-miR124-3p、mmu-miR21a-3p、 mmu-miR29c-5p、mmu-miR3473b和mmu-miR3473e;下调的2个miRNA是mmu-miR-150-3p和mmu-miR-503-5p。进一步阐明了IPA的发生发展的分子机制,为寻找有效的IPA早期诊断及疾病进展的生物分子标志提供了充足的理论依据。3IPA中显著差异表达的miRNA主要参与的KEGG通路为Cysteine and methionine metabolism signaling pathway, Sulfur metabolism signaling pathway和Carbon fixation in photosynthetic organisms pathways in cancer,但在这些信号通路中对其靶位点所起的作用,本实验不能完全阐述,有待后续试验进一步证实。