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目的:探究四肽重复蛋白17(TTC17)对乳腺癌转移的作用和机制。方法:我们首先通过CRISPR/Cas9全基因组敲除筛选技术,进行体外筛选得到乳腺癌转移相关的候选基因;同时利用乳腺癌组织全外显子测序结果结合TCGA乳腺癌数据进行数据分析,筛选得到与乳腺癌转移相关的64个基因,并构建64基因的CRISPR/Cas9基因敲除文库,通过裸鼠肺转移模型进行体内筛选。体内和体外筛选结果均提示TTC17具有调控乳腺癌转移的潜在功能。之后我们利用KM-Plotter、UALCAN和TCGA数据平台,分析TTC17在乳腺癌患者中的表达情况;同时利用乳腺癌MDA-MB-231、MCF7、4T1细胞系进行体内体外实验验证TTC17调控乳腺癌转移的作用,体外实验主要包括细胞侵袭、划痕愈合实验、克隆形成实验;体内实验主要利用4T1原位乳腺癌模型和MDA-MB-231肺转移模型。为了进一步探究TTC17影响乳腺癌转移的机制,我们将TTC17敲除/对照MDA-MB-231细胞系进行转录组测序,运用富集分析、分子生物学实验及相关通路抑制剂进行机制验证。此外,为了寻找能够逆转TTC17表达量降低所导致恶性表型的上市抗癌药物,我们进行313种上市抗癌药物库体外筛选。最后我们利用乳腺癌临床队列组织的免疫组化染色,验证TTC17的蛋白表达与乳腺癌转移的关系。结果:通过CRISPR/Cas9敲除文库的体内外筛选技术,联合乳腺癌组织全外显子测序数据以及TCGA乳腺癌数据分析,确定了 TTC17具有调控乳腺癌转移的潜在功能。之后我们通过对TCGA和CPTAC的乳腺癌数据分析,发现TTC17在乳腺癌组织中表达下调,其表达水平随肿瘤进展而降低。KMPLOT生存分析结果显示TTC17低表达量的患者无复发生存期显著低于其高表达患者。体外实验结果显示敲除或敲低TTC17基因均能显著增强乳腺癌细胞的侵袭能力、划痕愈合能力;过表达TTC17基因可以抑制乳腺癌细胞侵袭能力、划痕愈合能力、克隆形成能力。体内原位乳腺癌动物模型和肺转移模型,均显示TTC17基因的低表达能够显著促进乳腺癌的肺转移能力。我们对转录组测序数据分析得到的差异基因进行KEGG富集分析显示TTC17调控基因主要富集在RAP1通路和TGF-β通路。同时,我们利用cBioportal检索发现,TTC17的mRNA表达水平与RAP1信号通路相关成员的mRNA表达水平呈显著负相关。本研究发现在乳腺癌细胞系中敲低TTC17后RAP1A和CDC42(均为RAP1通路的关键分子)蛋白水平显著升高,利用ML141抑制CDC42活性后能够逆转TTC17表达量降低所致的乳腺癌细胞划痕愈合能力增强的表型。另外,我们通过Western blot实验发现敲低TTC17后TGF-β2的蛋白水平表达显著降低。药物库筛选发现,敲低TTC17的乳腺癌细胞系和对照细胞系对于多种上市抗肿瘤药物例如 Pirfenidone、Paclitaxel、Palbociclib、Rapamycin 等的药物敏感性不同。值得注意的是其中雷帕霉素(Rapamycin)具有抑制CDC42活性的功能,吡非尼酮(Pirfenidone)是TGF-β通路的抑制剂,以上进一步验证TTC17具有调控RAP1和TGF-β信号通路功能。最后,我们利用免疫组化染色发现,TTC17在发生转移的乳腺癌组织中的表达量低于未发生转移的乳腺癌组织。结论:TTC17能够抑制乳腺癌的侵袭和转移,TTC17表达量水平较低的患者预后较差,RAP1/CDC42信号通路和TGF-β信号通路是TTC17调控乳腺癌转移的潜在通路。本研究为发生转移的乳腺癌患者的相关治疗提供了新的潜在靶点,同时也为乳腺癌转移的诊断和预后判断提供了新的潜在靶标。目的 探讨溴结构域和WD重复蛋白3(BRWD3)对乳腺癌淋巴结转移的影响及其作用机制。方法 采用体外细胞侵袭实验探究BRWD3对乳腺癌细胞系的侵袭表型的调控作用。采用裸鼠淋巴结转移和肺转移模型探究BRWD3调控裸鼠乳腺癌淋巴结转移和肺转移的作用。通过cBioPortal数据库检索BRWD3共表达基因,进行生物功能及通路的聚类分析,构建BRWD3分子调控网络,并采用Western blot进行部分验证。采用公共数据库数据和KM-Plotter分析平台分析BRWD3在乳腺癌中的表达情况及BRWD3与乳腺癌预后的关系。结果 体外实验结果显示,敲除BRWD3能够显著促进乳腺癌细胞系的侵袭和迁移同时抑制乳腺癌细胞的增殖。裸鼠淋巴结转移模型显示,敲除BRWD3能够显著促进乳腺癌的淋巴结转移。但裸鼠肺转移模型显示,BRWD3并未影响乳腺癌的BALB/c裸鼠小鼠肺转移能力。GO功能分析显示,BRWD3共表达基因主要富集基因表达调控、DNA损伤修复、染色体的组织与修饰和蛋白质泛素化等生物学功能。KEGG富集分析显示,BRWD3共表达基因主要参与蛋白质泛素化、氧化磷酸化、MAPK等信号通路。Western blot检测证实,敲除BRWD3能够促进ERK1/2的磷酸化。BRWD3促进乳腺癌淋巴转移的机制可能与这些途径有关。BRWD3发生淋巴结转移乳腺癌中的表达量显著低于未发生淋巴结转移的患者,同时在KM-Plotter进行生存分析发现,BRWD3低表达患者的预后较差,其生存期显著低于BRWD3高表达患者。结论 BRWD3能够抑制乳腺癌的侵袭和体内淋巴结转移,BRWD3低表达患者预后较差。BRWD3可能亦具有调控通路蛋白质泛素化、氧化磷酸化、MAPK通路等功能,该发现为乳腺癌淋巴结转移相关分子标志物的研究和应用提供了新的理论基础。