第一部分小鼠CatSper1基因重组质粒的构建和表达目的:获得能表达CatSper1基因开放读码框的质粒,在真核细胞中表达CatSper1 mRNA,以用于筛选有效siRNA。方法:利用已有文献及网络资源进行雄性小鼠CatSper1基因的生物信息学分析,以重组PCR的方法,以小鼠睾丸cDNA为模板扩增CatSper1基因开放读码框,将CatSper1片段插入到载体pEGFP-N1的多克隆位点上,获取pEGFP-N1-CatSper1质粒,并对其进行测序验证。结果:通过重组PCR技术,成功克隆了雄性小鼠CatSper1基因整个开放读码框的cDNA,全长为2061bp。将其插入到载体pEGFP-N1的多克隆位点中,测序证实了克隆和载体构建的正确性。结论:对预测的小鼠CatSper1基因的克隆,将CatSper1片段插入到载体pEGFP的多克隆位点上,成功获取了pEGFP-N1-CatSper1重组质粒。第二部分体外有效siRNA序列的筛选目的:利用化学合成小分子siRNA,干扰小鼠成神经瘤N2a细胞外源CatSper1基因的表达,筛选出抑制效果最佳的siRNA序列。方法:生物信息分析软件和校正结果,获得三条针对雄性小鼠CatSper1的siRNA序列,合成后分别与重组质粒pEGFP-N1-CatSper1共转染到小鼠成神经瘤N2a细胞株中,通过观察EGFP荧光强度、实时定量PCR和Western Blot等方法分析干扰效果,筛选能显著降低N2a细胞中外源性CatSper1表达量的RNAi序列。结果:三条针对CatSper1的siRNA组的mRNA和蛋白表达与空白对照组相比均有下降,其中以靠近3’端的siRNA(1870-CCTTGAAGATGCAGCTTAT-1889)干扰作用最为明显,siRNA3组为最佳干扰序列,与空白对照组比较降低了79%。阴性对照siRNA组未引起CatSper1 mRNA和CatSper1蛋白表达的明显变化。结论:利用真核表达外源性CatSper1,筛选出有效的siRNA,为应用RNAi研究CatSper1功能及用于避孕提供参考。