本论文以力学因素为主要干预手段对大鼠尾椎间盘干预，运用核磁共振（MRI）、TUNEL法、RT-PCR法、免疫荧光定量、流式细胞仪、共聚焦显微镜、Western Blot等各种方法对椎间盘退变的相关指标进行检测，本研究共包括三个部分。第一部分大鼠尾椎间盘退变模型建立及影像学、组织形态学变化目的：建立一种新型力学因素诱导的大鼠尾椎间盘退变模型，通过影像和组织学观测验证模型的可靠性。方法：24只SD大鼠，随机分为对照组和实验组，每组12只，实验组大鼠用3.6%水合氯醛腹腔麻醉（10ml/Kg），安装外固定架并按等同大鼠体重力量加压，对照组不安装外固定架。两组分别于术前全部及术后2、4、8周各随机抽取4只大鼠行MRI检查，测量矢状面T2WICo7~8、Co8~9和Co9~10椎间盘髓核MEANS值，采用椎间盘MRI评价标准进行退变程度分度。在MRI检查后，麻醉处死大鼠，取Co7~8、Co8~9和Co9~10椎间盘组织块，甲醛固定，HE染色、胶原蛋白免疫组化检测。结果：MRI检查：对照组椎间盘T1WI中低信号，T2WICo8~9髓核呈高信号。实验组术后2周T2WICo8~9髓核信号降低，MEANS值降低。术后4周T2WI椎间隙变窄，Co8~9髓核信号明显降低，MEANS值明显降低。术后2、4、8周实验组与对照组T2像上Co8~9髓核MEANS值比较均有统计学意义（P<0.05）。HE染色：对照组见髓核细胞数量多、排列均匀，纤维环各层排列整齐。实验组Co8~9在术后2周见髓核细胞减少，纤维环排列紊乱。术后4周髓核细胞进一步减少，出现成维样细胞。8周髓核几乎被纤维软骨组织替代，纤维环排列不整齐，与髓核界限不清。免疫组化：对照组Co8~9髓核组织中Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原染色呈规整网状。实验组Co8~9髓核和纤维环术后4周、8周与对照组相比，Ⅱ型胶原染色变浅，网状结构破坏。结论在国内首次构建了外固定架固定应力型椎间盘退变模型并首次采用MRI对鼠尾椎间盘退变进行观测。与国外同类模型相比，外固定架固定四节段椎间盘退变模型消除了椎间盘退变的营养因素影响，为研究椎间盘退变的机理及治疗方法提供了好的模型。第二部分退变椎间盘组织中IL-1β、MMP-2的表达与p38介导髓核细胞凋亡目的：通过对大鼠退变尾椎间盘组织中IL-1β、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）表达的研究，探讨IL-1β、MMP-2在椎间盘退变中的作用及其与p38介导髓核细胞凋亡的相关性。方法：椎间盘组织HE染色：术后4周，对照组和实验组各随机抽取5只大鼠，过量麻醉处死，迅速取出Co8~9椎间盘组织（分离髓核和纤维环），甲醛溶液固定24h。标本经脱钙、脱水、透明、浸蜡、包埋后切片。TUNEL标记检测细胞凋亡：术后4周，两组各随机取5只大鼠，取出Co8~9椎间盘髓核和纤维环，TUNEL标记检测细胞凋亡。Quantitative Real-time PCR检测IL-1β、MMP-2、Collagen Ⅱ基因：4周时两组各随机选15只，取出Co8~9椎间盘髓核和纤维环，用PBS反复冲洗后立即置于Trizol溶液中用于荧光定量RT-PCR检测。Western Blot检测p38蛋白及其磷酸化水平：术后4周，两组各随机取大鼠5只，取Co8~9椎间盘髓核和纤维环，蛋白免疫印迹检测细胞内p38蛋白及其磷酸化水平。结果：实验组Co8~9术后4周可见髓核细胞密度增加，胞外基质减少，纤维环排列紊乱。髓核细胞发生凋亡，凋亡指数为0.29，细胞凋亡指数两组之间有统计学差异（P<0.05）。实验组髓核组织IL-1β的mRNA水平与对照组相比升高2.63±0.33倍（P<0.05），纤维环组织IL-1β的mRNA水平升高8.50±0.16倍（P<0.05）；实验组髓核组织MMP-2的mRNA水平与对照组相比则升高8.87±0.24倍（P<0.05）；与对照组相比，Collagen Ⅱ在髓核和纤维环中下降至0.15±0.09倍和0.44±0.17倍（P<0.05）。实验组髓核组织p38蛋白含量表达与对照组比较无明显差异。p38蛋白磷酸化水平明显升高，p-p38/β-actin比值对照组仅0.12±0.02，而实验组比值达0.63±0.05，两者之间有明显差异（P<0.05）。椎间盘发生退变后p38蛋白磷酸化水平提高，p38蛋白活性增强。结论：退变的椎间盘髓核细凋亡明显增加，胞外基质成分减少。实验组椎间盘组织中IL-1β的含量明显高于正常组椎间盘组织，进一步证实了IL-1β参与椎间盘的退变过程。此外，发现IL-1β表达量与MMP-2有相关性，说明IL-1β在椎间盘退变过程中与MMP-2相互作用，共同促进组织退变。在国内首次证实退变椎间盘髓核细胞中p38MAPK蛋白磷酸化水平明显增高，蛋白活性增强，诱导凋亡。第三部分退变椎间盘整合素α5β1的表达及力学信号转导目的：在应力加压型椎间盘退变模型中，研究椎间盘组织内整合素α5β1的表达、活化情况、检测其下游信号分子变化，探讨力学信号经整合素α5β1转导的可能机制。方法：免疫组织化学检测组织中整合素α5定位及定量表达：术后4周，两组各随机抽取3只大鼠，过量麻醉处死，迅速取出Co8~9椎间盘组织（分离髓核和纤维环，下同），甲醛溶液固定24h。石蜡切片采用免疫组化法检测整合素α5定位及定量表达，切片光镜观察。免疫荧光检测组织细胞表面整合素α5定位表达：术后4周，两组各随机抽取2只大鼠，麻醉处死，迅速取出Co8~9椎间盘组织、固定、漂洗、孵育、滴加特异性一抗、二抗、漂洗、DAPI复染细胞核、核甘油磷酸缓冲液封片，荧光显微镜下镜观察。流式细胞计数检测细胞表面整合素α5β1定量表达：术后4周，两组各随机抽取15只大鼠，麻醉处死，迅速取出Co8~9椎间盘组织，并用眼科剪剪碎至糊状悬液，加入0.25%胰蛋白酶和0.2%胶原蛋白酶适量，消化组织悬液。通过尼龙网过滤成单细胞悬液。离心后加入50ml缓冲液重悬细胞后计数，需要时予台盼蓝（Trypan Blue）检测细胞活性。采用间接标记的一抗，加入整合素α5抗体，并加入FITC二抗冰上孵育，细胞荧光染色。Quantitative Real-time PCR检测整合素α5β1基因：术后4周，两组各随机抽取5只大鼠，麻醉处死，迅速取出Co8~9椎间盘组织，细胞总RNA用TRIzol抽提，以oligo dT为引物，反转录为cDNA。使用SYBR green方法进行实时定量PCR。Western Blot检测FAK及其磷酸化水平：术后4周，两组各随机取5只大鼠，取Co8~9椎间盘髓核和纤维环。蛋白免疫印迹检测细胞内FAK及其磷酸化水平。结果：免疫组化染色显示对照组髓核细胞表面有大量整合素α5表达，分布较均匀；实验组加压4周后，退变的椎间盘髓核细胞散在分布，细胞表面染色不均。免疫荧光检测见两组髓核和纤维环细胞膜上均有整合素α5表达，实验组表达减少、荧光强度减弱。流式细胞计数检测细胞表面整合素α5β1定量表达，在实验组髓核和纤维环组织流式细胞计数平均荧光强度下降，与对照组相比有统计学差异（P<0.05）。实验组髓核组织整合素α5的mRNA水平与对照组相比略升高，纤维环组织整合素α5稍下降；实验组髓核和纤维环组织整合素β1的mRNA水平比对照组略升高。但各组之间mRNA变化水平均无统计学差异（P>0.05）。实验组髓核组织FAK蛋白含量表达与对照组比较无明显差异。实验组FAK蛋白磷酸化水平明显升高，p-FAK/β-actin比值对照组为0.15±0.07，而实验组比值0.42±0.11，两者有明显差异（P<0.05）。实验组椎间盘发生退变后p-FAK（FAK-Y397）表达明显高于对照组。结论：首次证实整合素α5在大鼠退变椎间盘髓核细胞表达减少；在力学负荷下，整合素下游信号分子FAK磷酸化水平明显增高，证明整合素的活性增强。