论文部分内容阅读
α-檀香醇和β-檀香醇含量是衡量檀香精油质量的重要指标。檀香的商业价值主要在于其具芳香气味的心材，收获高质量的心材是种植檀香的最终目的。因此，提高檀香精油中檀香醇的含量已成为急需解决的问题。檀香醇是倍半萜类化合物，而倍半萜类主要通过甲羟戊酸(MVA)途径合成。乙酰乙酰辅酶A转移酶(AACT)、3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A合成酶(HMGS)、3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)、甲羟戊酸激酶(MK)以及5-磷酸-甲羟戊酸激酶(PMK)是MVA途径重要的酶。萜类合成酶(TPS)是合成萜类化合物的关键酶之一。这些基因在檀香心材中表达量的变化能直接或间接的影响萜类代谢途径，从而影响檀香醇的合成。因此，本研究以檀香为材料，通过RT-PCR和RACE技术克隆了萜类化合物MVA途径5种相关酶以及一种萜烯合成酶:AACT、HMGS、HMGR、MK、PMK以及TPS基因全长，并对其进行了生物信息学、表达模式以及原核表达分析。本研究为深入了解檀香精油中主要萜类化合物-檀香醇生物合成的分子机理和促进檀香提早结香奠定了理论基础，也为推进檀香中萜类化合物的相关研究提供了理论依据。本文主要研究结果如下: 1.通过0.42％BA处理未结香幼龄檀香，结果表明:0.42％BA处理对檀香树高、胸径无明显效果，但是能显著促进檀香心材纵向伸展以及提高檀香油心材及边材精油含量。0.42％BA处理对促进檀香心材纵向伸展以及提高檀香油心材及边材精油含量都有效果，处理组檀香心材精油中α-檀香醇和β-檀香醇的相对含量均符合国际标准。 2.根据檀香叶片转录组数据通过RACE技术成功克隆了6个檀香醇合成相关基因，分别命名为SaAACT、SaHMGS、SaHMGR、SaMK、SaPMK以及SaTPS，并对其进行了生物信息学分析。结果表明:SaAACT编码的蛋白属于缩合酶超级家族中硫解酶;SaHMGS编码的蛋白N末端属于缩合酶超级家族，C末端属于HMG-CoA合成酶-C超级家族;SaHMGR编码的蛋白属于HMGR超级家族中HMGRⅠ类酶;SaMK编码的蛋白N末端属于GHMP_kinases_N超级家族，C末端属于GHMP_kinases_C;SaPMK编码的蛋白N末端属于GHMP_kinases_N超级家族;SaTPS编码的蛋白，属于萜烯环化酶超级家族中的Ⅰ类酶。亚细胞定位分析表明:SaAACT和SaPMK有可能定位于叶绿体中;SaHMGS、SaHMGR和SaTPS有可能定位于细胞质基质中;SaMK有可能定位于细胞核中。多序列比对和进化树结果表明:SaAA CT和SaMK分别与橡胶树AACT基因和MK基因的相似性最高;SaHMGS与可可树中的HMGS相似性最高，SaHMGR与莲HMGR基因的相似性最高、SaPMK与桑树中的PMK基因相似性最高，SaTPS与已有的檀香檀香烯香柠檬烯合成酶的相似性最高。 3.对SaAACT、SaHMGS、SaHMGR、SaMK、SaPMK和SaTPS基因在檀香不同组织中的表达量进行qRT-PCR检测，结果表明:6个基因在檀香根、未结香茎、已结香心材、幼叶、成熟叶和小枝中均有表达，其中，除SaMK基因外，其余基因均是在根中的表达量最高，而SaMK基因在幼叶中的表达量最高。SaAACT、SaHMGR、SaPMK与SaTPS在幼叶中的表达量最低，而SaHMGS和SaMK在未结香茎干中的表达量最低。 4.构建了原核表达载体pET32a-SaTPS。并通过适当浓度IPTG诱导，初步表达出了融合蛋白。同时通过His标签蛋白纯化试剂盒纯化初步得到了重组TPS蛋白。