研究背景和目的大肠癌是常见的恶性肿瘤之一,近十年来,大肠癌在我国的发病率呈逐年上升的趋势。转移是影响患者治疗效果和死亡的主要原因,探讨与大肠癌转移相关的因素,寻找预防和治疗的有效途径,是当代肿瘤学研究的一项迫切任务。SDCBP (syntenin)全名syndecan binding protein即多配体聚糖结合蛋白定位于8q12,全长2173bp,有9个外显子8个内含子,编码298个氨基酸。SDCBP在胎儿的肾、肝、肺、大脑中表达,在成人的心脏和胎盘中高表达。SDCBP蛋白包含两个连接着的PDZ区域,通过它的两个PDZ功能基团可与许多细胞膜受体胞内末端或细胞内的信号分子结合,调控多种重要的细胞生理过程和信号传导途径,包括白介素、蛋白质等物质的结合及活化,细胞粘着,细胞骨架形成,生长因子活化,细胞连接,细胞运动等。SDCBP与恶性黑色素瘤、胃癌以及乳腺癌等疾病相关,在恶性黑色素瘤、胃癌以及乳腺癌中促进肿瘤的转移及发展,大肠癌中未见报道。本研究重点探讨SDCBP基因对大肠癌增殖、侵袭及转移的影响和作用机制,阐明SDCBP在大肠癌转移中的主要生物学功能,为大肠癌转移的早期诊断和治疗奠定理论基础。研究方法1.大肠癌组织中SDCBP的表达及临床意义应用免疫组化S-P法,检测109例有十年随防资料的大肠癌病例中SDCBP的表达,分析SDCBP的表达与大肠癌各临床因素的关系,用Kaplan-Meier和Cox回归分析法进行生存分析。2. SDCBP基因沉默对大肠癌细胞生物学特性的影响。用RT-PCR方法检测SDCBP基因在大肠癌细胞株中的表达,筛选SDCBP表达较高的细胞株；设计并挑选有效地SDCBP基因干扰片段,进行慢病毒包装,将慢病毒导入内源性表达SDCBP基因较高的人大肠癌HT29、SW480细胞株中,细胞流式分选稳定细胞株,Westernblot鉴定转染后SDCBP基因在细胞中的表达；观察SDCBP基因干扰前后,细胞增殖、体外运动迁移能力的变化。3. SDCBP基因参与大肠癌相关信号通路的初步研究。Westernblot检测HT2、SW480大肠癌细胞株中SDCBP沉默后,PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路中p-AKT、AKT、p-ERK、ERK的表达变化。研究结果：1.大肠癌组织中SDCBP的表达及临床意义1.1SDCBP与大肠癌各临床因素之间的关系在109例大肠癌组织中SDCBP的高低表达率分别为52.3%(n=57),47.7%(n=52),结果显示大肠癌的年龄,性别,浸润深度,分化程度以及组织类型与SDCBP在大肠癌组织中的表达没有关系；而无淋巴结转移的大肠癌中SDCBP的表达显著低于有淋巴结转移的大肠癌(z=-3.238,P=0.001)。1.2SDCBP对大肠癌患者术后生存时间的影响为了确定SDCBP表达与大肠癌患者预后的关系,采用Kaplan-Meier法描述生存曲线及Log-rank法检验其统计学意义。在随访期内病例最短有效随访时间为七年,结果显示在随访期内SDCBP(?)表达组3年、5年、七年累积生存率分别为75.0±6.0(%)、69.2±6.4(%)、61.5±6.7(%)；高表达组3年、5年、7年累积生存率分别为57.9±6.5(%)、45.6±6.6(%)、38.6±6.4(%)；低表达组平均生存时间为86.154±6.289(月),高表达组平均生存时间为60.443±5.903(月)。其差异经Log-rank检验其差异有统计学意义(x2=8.336,P=0.004)1.3其他各临床因素对大肠癌术后生存时间的影响其他各临床因素中淋巴结转移情况对患者术后生存时间有显著性影响,无淋巴结转移组平均生存时间为86.184±5.358(月),3年、5年、7年累计生存率为78.1±5.2(%)、65.6±5.9(%)、60.9±06.1(%)；有淋巴结转移组术后平均生存时间为52.300±6.508(月)、3年、5年、7年累计生存率为48.9±0.075(%)、40.0±7.3(%)、33.3±7.0(%)。其差异经Log—rank检验有统计学意义(x2=10.585,P=0.001)；而患者的性别,年龄,组织的分化,病理类型及大肠癌的浸润深度对术后生存时间无显著性影响。1.4影响生存期的Cox模型多因素分析单因素分析结果显示淋巴结的转移及SDCBP的表达对患者的预后有显著影响,将这两个因素经多因素Cox分析发现淋巴结的转移以及SDCBP的高表达显著增加患者的死亡风险(B=0.677,P=0.013；B=0.605,P=0.034)。Cox模型检验结果说明SDCBP的高表达及淋巴结的转移可以作为患者预后的独立危险因素。2.通过RNAi技术沉默大肠癌细胞株SDCBP表达,建立SDCBP基因稳定沉默的大肠癌细胞株2.1验证基因芯片结果在前期试验中我们在大肠癌细胞SW480以及其亚系SW480-SCP51, SW480-SCP58中应用全基因组表达谱芯片筛选出差异显著性基因SDCBP。本实验采用荧光定量PCR检测这三株细胞中SDCBP基因mRNA的表达,结果显示在这三株细胞中SW480-SCP58中SDCBP的表达显著低于SW480以及SW480-SCP51中的表达,经单因素方差分析以及LSD法两两比较显示其差异具有统计学意义(P<0.05)。荧光定量检测结果与前期基因芯片检测结果一致。2.2大肠癌细胞株中SDCBP基因的表达应用荧光定量PCR、Westernblot检测6种大肠癌细胞株中SDCBP基因的表达,其结果经单因素方差分析以及多重比较显示SDCBP在HT29、SW480、 LS174T细胞中的表达显著升高,而在细胞HCT116、Caco-2、SW620中则显著降低(P<0.05)。2.3稳定干扰细胞株的建立构建了四个干扰SDCBP基因表达的干扰片段以及阴性对照片段5’-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3’,将干扰片段分别转染HT29细胞,发现5’-GCAAGACCTTCCAGTATAA-3’干扰片段干扰效率最高。将干扰片段以及阴性对照片段分别进行慢病毒包装。将包装产生的两种慢病毒(实验组命名为Lentivirus-shRNA-SDCBP,对照组命名为Lentivirus-shRNA-NC)分别感染HT29、SW480细胞株。流式细胞仪分别分选出GFP+的细胞继续进行培养。分别命名为HT29-SDCBP-、HT29-NC、SW480-SDCBP-、SW480-NC。细胞培养传代一个月后经流式细胞仪检测GFP+细胞比例均达到95%以上,westernblot检测SDCBP蛋白的表达量,经检测HT29-SDCBP-、SW480-SDCBP-细胞株中SDCBP的蛋白表达量显著低于HT29-NC、SW480-NC细胞株。3. SDCBP沉默对大肠癌细胞株HT29、SW480细胞生物学特性的影响3.1SDCBP沉默对大肠癌细胞株HT29、SW480细胞周期的影响。采用流式细胞仪的方法分别分析HT29-NC、HT29-SDCBP两组细胞以及SW480-NC、SW480-SDCBP-两组细胞的细胞周期分布。实验结果表明,HT29-NC、HT29-SDCBP-两组细胞的细胞增殖率(合成期S+合成后期G2/分裂期M)分别为37.4067%和27.7000%,SDCBP基因沉默组HT29-SDCBP-与对照组HT29-NC相比,细胞的增殖率显著降低,其差异具有统计学意义(t=12.006；P=0.000)；在SW480-NC、SW480-SDCBP两种细胞的细胞增殖率(合成期S+合成后期G2/分裂期M)分别为41.5767%和30.4000%,SDCBP基因沉默组SW480-SDCBP-与对照组SW480-NC相比,细胞的增殖率显著性降低,其差异具有统计学意义(t=12.347；P=0.000)。说明SDCBP基因的干扰抑制HT29、SW480细胞的增殖速度。3.2平板克隆实验检测SDCBP的沉默对细胞克隆形成能力的影响HT29-NC、HT29-SDCBP-两组细胞以及SW480-NC、SW480-SDCBP-两组细胞均能在平板中形成克隆,HT29-NC、HT29-SDCBP-两组细胞克隆形成率分别为73.5000±5.56776(%)和67.8333±4.53689(%),采用两独立样本t检验分析发现两组细胞的克隆形成能力不具有显著性差异(t=1.367,P=0.246)；SW480-NC、SW480-SDCBP-两组细胞的克隆形成率分别为45.3333±4.01040(%)和40.6667±4.36845(%),采用两独立样本t检验分析发现两组细胞的克隆形成能力不具有显著性差异(t=1.363,P=0.245)；提示SDCBP基因沉默后,大肠癌细胞单个细胞的生长增殖形成克隆的能力没有显著性变化。33CCK8细胞活性检测试验检测细胞增殖能力。采用CCK8细胞活性检测试验检测SDCBP抑制后细胞增殖能力的变化,并绘制生长曲线。析因方差分析结果显示,HT29细胞株中两组间细胞增殖能力差异明显(F=1242.374,P<0.001),两个组别生长时间水平差异具有显著性(F=4357.636,P<0.001),时间与分组之间交互效应显著(F=141.215,P<0.001)；SW480细胞株中两组间细胞增殖能力差异明显(F=1496.071,P<0.001),两个组别生长时间水平差异具有显著性(F=3851.319,P<0.001),时间与分组之间交互效应显著(F=198.515,P<0.001)；从两株细胞的增长曲线以及统计分析结果说明抑制SDCBP能够抑制大肠癌细胞HT29,SW480的体外增殖能力。3.4运动小室实验检测SDCBP的抑制对HT29、SW480细胞运动迁移能力的影响。采用Transwell小室的方法检测SDCBP抑制后细胞体外迁移运动能力的变化,通过各组细胞穿过人工基底膜细胞数量的多少来评估各组细胞迁移运动的能力,结果发现HT29-NC、HT29-SDCBP-两组细胞穿过基底膜的数量分别为19.67±2.517、15.67±2.082,没有显著性差异(t=2.121,P=0.101)；SW480-NC、 SW480-SDCBP-两组细胞穿过基底膜的数量分别为136.33±8.505、93.33±11.676,其差异具有显著性(t=5.156,P=0.007)。此结果表明SDCBP基因的沉默对大肠癌HT29细胞体外的运动迁移能力有所抑制,但其影响并不显著；而在大肠癌细胞SW480中SW480-SDCBP-其运动能力较SW480-NC明显降低,说明SDCBP基因的沉默能够抑制SW480细胞的迁移运动能力。4. SDCBP相关信号通路的检测SDCBP基因的沉默对大肠癌细胞HT29、SW480中PI3K/Akt及MAPK/ERK信号通路蛋白AKT、ERK2、p-AKT、p-ERK表达的影响。利用Western blot检测HT29-NC、HT29-SDCBP-两组细胞以及SW480-NC、SW480-SDCBP-两组细胞中AKT、ERK2、p-AKT、p-ERK的表达,结果显示p-AKT和p-ERK在HT29-SDCBP-组细胞中的表达比HT29-NC组降低,而AKT和ERK2总蛋白量在2组间无明显差异；p-AKT和p-ERK在SW480-SDCBP-组细胞中的表达比SW480-NC组降低,而Akt和ERK2总蛋白量在2组间无明显差异。结论1.研究结果初步证实SDCBP基因是大肠癌增殖、侵袭、转移的促进基因。2.研究结果初步证实SDCBP可能通过参与PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路的调控,从而促进大肠癌细胞的增殖、侵袭和转移。