抗葡萄球菌嵌合蛋白P128是由葡萄球菌噬菌体K细胞壁降解酶活性区与溶葡萄球菌素细胞壁结合区组成的杂合肽,对耐药葡萄球菌具有较强的溶(杀)活性。国外用大肠杆菌成功表达了重组P128,但需两步硫酸铵沉淀和离子交换层析纯化。本课题组以类弹性蛋白多肽(Elastin-likepolypeptide,ELP)为纯化标签,用脑膜炎奈瑟氏菌FrpC蛋白自加工元件切割ELP标签,但切割效率较低,重复性较差。烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus,TEV)蛋白酶是该病毒核包涵体蛋白酶的催化活性区,具有识别序列特异性强、切割活性受目的蛋白氨基酸序列影响小和反应兼容性好等优点。本课题组研制的自聚肽融合TEV蛋白酶不仅可用离心洗涤法分离纯化,而且切割反应结束后能用离心法去除。本研究探索用自聚肽融合TEV蛋白酶切割ELP标签可行性,旨在提高重组P128产量,为相关基因工程产品开发打好基础。用PCR扩增P128编码序列,5’端引入TEV蛋白酶切割位点,将PCR产物插入融合表达载体pELP-Fh8,用重组载体pELP-Fh8-P128转化大肠杆菌,对IPTG浓度等表达条件进行了优化,结果显示ELP-Fh8-P128融合蛋白获得正确表达,表达产物为可溶性蛋白。利用温度敏感相变循化(ITC)纯化融合蛋白,对相变温度和盐浓度进行了优化,经两轮ITC获得的ELP-Fh8-P128融合蛋白纯度达90%。对TEV蛋白酶活性包涵体表达、纯化和切割条件进行了优化,用离心洗涤法获得了高纯度融合蛋白酶。在优化条件下切割ELP-Fh8-P128融合蛋白,用ITC去除ELP-Fh8标签,结果显示切割效率高达95%,获得的重组P128纯度达98%,产量为75mg/L细菌培养。收集奶牛乳房炎相关金黄葡萄球菌11株,凝固酶阴性葡萄球菌31株,通过药敏试验筛选耐头孢西丁菌株7株,进而用重组P128分别进行抑(杀)菌试验,用MTT法检测P128对牛肾细胞的细胞毒性。结果显示:除对1株耐头孢西丁金黄和沃氏葡萄球菌无效外,重组P128对9株金黄葡萄球菌的抑菌活性在0.23～0.94μg/ml之间,杀菌活性在0.94～15μg/ml之间;对6种凝固酶阴性葡萄球菌的抑菌活性在0.12～1.88μg/ml之间,杀菌活性在0.94～30μg/ml之间;对耐头孢西丁葡萄球菌的抑(杀)菌活性低于敏感菌株;对牛肾细胞无明显细胞毒性。