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研究背景:去势治疗仍然是针对局部进展和转移性前列腺癌的主要手段。遗憾的是,虽然大多数前列腺癌患者最初对去势治疗反应敏感,但许多肿瘤最终都会从激素敏感性前列腺癌（HDPC）进展为去势抵抗性前列腺癌（CRPC）。近年的研究报道提示雄激素受体AR在CRPC进展中发挥关键角色。而去势诱导的低氧可以促进AR转录激活和CRPC进展,植物同源结构域锌指蛋白8（PHF8）作为组蛋白去甲基化酶家族中一员,高表达于包括前列腺癌在内的多种肿瘤中。我们现在的研究设计基于探索PHF8在去势诱导的低氧和AR转录激活过程中扮演的关键作用。研究方法:第一,免疫组织化学技术用于分析97例病人组织样本,包括16例良性前列腺增生（BPH）,16例前列腺上皮内瘤变（PIN）和65例来自于组织芯片的前列腺癌病人。基于免疫组化染色评分,65例前列腺癌病人被分成PHF8高表达组（33例）和低表达组（32例）。Pearson卡方检验分析PHF8表达与肿瘤相关变量的关系。我们实施Kaplan-Meier曲线对随访数据进行生存分析。第二,经直肠彩色超声多普勒用于分析去势前后前列腺癌组织血供情况。免疫组化和免疫印迹实验用于比较14例进展性前列腺癌病人去势前后PHF8,HIF1αand HIF2α表达水平差异。第三,我们在缺氧条件下（1%O2）培养三种前列腺癌细胞系LNCa P,22RV1 and DU145分别0,12和24h,用免疫印迹和荧光定量PCR技术分别检测PHF8表达和m RNA表达。为了检测低氧诱导的PHF8表达是依赖于HIF家族转录因子调控,我们在LNCa P细胞中用sh RNAs敲低HIF1a或HIF2a表达,然后低氧处理（16）（17）h观察PHF8表达变化。我们通过荧光素酶报告系统检测HIF转录因子是否直接调控PHF8表达。第四,我们用免疫印迹实验比较常氧和低氧条件下PHF8底物H3K9me1,H3K9me2和H4K20me1的整体水平,同时在LNCa P和PC-3细胞中分析PHF8敲低对上述甲基化蛋白水平的影响。最后,我们用PHF8过表达质粒瞬时转染LNCa P和PC-3细胞,用免疫荧光染色分析常氧（21%O2）和低氧（1%O2）条件下PHF8过表达使组蛋白去甲基化的能力。第五,我们用免疫印迹和荧光定量PCR技术检测了PHF8敲低对激素诱导的PSA和NKX3.1转录激活的影响。染色质免疫共沉淀（Ch IP）用于分析在激素或去激素处理条件下PHF8对AR的转录激活作用以及低氧条件下PHF8招募到PSA和NKX3.1启动子区域情况。第六,我们在293FT细胞中过表达GFP标签的AR和Flag标签的PHF8野生型或突变型质粒;在激素或去激素条件下处理24h,用GFP或Flag抗体实施免疫共沉淀实验。PHF8与AR的内源性免疫共沉淀实验在LNCa P细胞中进行。最后,我们将4x UAS-TK-luc报告基因,Gal4 DNA绑定结构域和AR（Gal-AR）,以及不同浓度梯度（照提示）的PHF8野生型或突变型（H247A）质粒转染入Hela细胞中,用荧光素酶报告实验检测PHF8对AR的转录激活作用。研究结果1.PHF8高表达与高的Gleason分级和不良预后相关在BPH到PIN再到高Gleason评分的前列腺癌患者组织中,PHF8表达呈逐渐上调的趋势。相比于PHF8低表达组,PHF8高表达组包括更多Gleason评分8-10的低分化前列腺癌患者。低Gleason评分肿瘤中PHF8呈现更多胞质染色,而在高Gleason评分肿瘤中PHF8呈现更多胞核染色。PHF8在BPH、激素敏感性前列腺癌和激素抵抗性前列腺癌组织中的表达也是与分化级别高度相关,在激素抵抗性前列腺癌组织中能观察到最高的PHF8表达水平。2.前列腺癌PHF8高表达与去势治疗诱导的低氧相关去势治疗减少了前列腺癌组织血流信号。同时在去势治疗后的临床样本中也观察到HIF1α,HIF2α和PHF8分布于胞质和胞核,并且呈高水平表达。3.低氧诱导前列腺癌细胞PHF8高表达三种前列腺癌细胞系LNCa P,22RV1和DU145分别低氧（1%O2）处理0,12和24h,PHF8蛋白和m RNA水平呈升高趋势。敲低HIF1a或HIF2a表达均降低了PHF8表达。HIF1a和HIF2a均能强烈诱导带有-1281到+1长度PHF8启动子的荧光素酶报告子转录激活。在低氧条件下,转录因子HIFs能绑定到PHF8的启动子区域激活其转录。4.低氧诱导的PHF8发挥去甲基化酶功能调节整体组蛋白甲基化水平在LNCa P和293FT细胞中,低氧诱导PHF8表达并且导致PHF8底物H3K9me1,H3K9me2和H4K20me1水平的下调,但没有影响非PHF8底物H3K9me3水平。在LNCa P和PC-3细胞中,敲低PHF8表达导致H3K9me1/2和H4K20me1水平的上调,但没有增加H3K9me3表达。在常氧（21%O2）和低氧（1%O2）条件下,在LNCa P和PC-3细胞中过表达PHF8诱导了H3K9me1,H3K9me2和H4K20me1水平的下调,但没有影响H3K9me3表达水平。5.PHF8招募到AR靶基因调控其转录激活在LNCa P和VCa P细胞中PHF8敲低显著减弱了DHT诱导的PSA和NKX3.1的转录激活。虽然与PSA和NKX3.1相比程度稍弱,PHF8敲低也显著减弱了DHT诱导的AR的转录激活;同样的结果也可以在去激素处理的22RV1细胞中观察到。在激素作用下,PHF8可以招募到AR靶基因PSA和NKX3.1的启动子上调控其转录。6.PHF8与AR相互作用转录激活AR是酶活性依赖性的在293FT和LNCa P中分别检测到外源性和内源性PHF8和AR的相互作用。共表达PHF8以剂量依赖方式增强AR转录活性。PHF8作为AR共刺激因子依赖于其去甲基化酶活性,因为在PHF8（H247A）突变型中没有观察到这种效应。研究结论:综上所述,我们的结果提示HIF/PHF8/AR信号轴的存在促进了前列腺癌进展。我们提出前列腺癌去势治疗诱导产生低氧微环境激活HIFs表达,而HIFs激活又促进PHF8表达。PHF8上调增强AR转录活性,促进前列腺癌进展,其机制至少部分通过激活AR信号通路。我们的研究提示HIF/PHF8/AR信号轴可能是前列腺癌进展的动力和治疗靶点。介于CRPC中低氧和PHF8表达升高,靶向针对PHF8和HIF信号通路可能是CRPC潜在的治疗方向。