研究背景和目的:经皮冠状动脉介入(PCI)治疗是继冠状动脉旁路手术(CABG)后治疗冠心病又一革命性突破,但PCI术后冠状动脉再狭窄(RS)严重影响其远期疗效,常规经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)后RS率高达40～60%,支架植入术后为20～40%。药物洗脱支架虽然可减少RS的发生,但术后RS率仍有10%左右,且费用昂贵,此外,药物洗脱支架植入后存在后期、远期支架内血栓形成而危及生命等问题。因而探索经济、有效的RS防治措施仍是心血管病学领域颇为重要的课题。RS的突出病理改变是血管内膜增生,对新生内膜增生的发生机制及防治研究已成为攻破RS的突破口。近来研究发现AngⅡ的2型受体(AT2R)具有拮抗AngⅡ的型受体(AT1R)的作用,对细胞的增殖、迁移具有负性影响,本实验室已有研究结果证明,通过局部导入AT2R使其表达增强,可以明显减轻新生内膜的面积。利用转基因技术治疗的过程中,导入体内基因的表达能否被实时、定量的控制甚为重要。正常情况下,AT2R在心血管组织中表达极少,若引入的AT2R基因表达处于无调控状态,将可能造成严重后果。因此,如何主动控制引入体内的靶基因需要得到解决。既往研究发现来源于骨髓的间充质干细胞(MSC)在血管内皮损伤后黏附于损伤的血管局部,在此基础上进一步分化为血管平滑肌细胞(VSMC)和内皮细胞,从而参与血管的损伤后修复过程。并且MSC具有多向分化潜能,容易通过转基因技术获得目标基因并在体内外长期表达,且取材方便,不存在组织配型及免疫排斥问题,是基因治疗中接受目标基因的优秀载体细胞。本实验体外观察MSC与VSMC在直接接触培养下的分化情况,并以MSC为载体,通过体外细胞基因转染及筛选,获得双重稳定受到强力霉素(Dox)调控表达AT2R基因的MSC,将此受到调控表达的AT2R基因导入大鼠颈动脉球囊损伤动物模型中,观察MSC细胞移植实现AT2R基因在体可调控表达在新生内膜中形成的作用及潜在意义。研究方法:(1)密度梯度离心法及胶原酶消化法分别培养原代大鼠MSC及VSMC,细胞共培养并行免疫荧光化学染色和透射电镜观察超微结构;(2)组成受Dox调控的哺乳动物表达系统(Dox-on)的四种成分的转化、扩增及提纯并酶切鉴定;(3)采用常规分子生物学方法连续两个回合转染体外培养的MSC,并分别采用发光计检测不同细胞克隆萤光素酶活性改变以及RT-PCR方法检测AT2R目的基因mRNA表达情况,根据各个细胞克隆受Dox调控表达的程度,选择低背景、高诱导表达AT2R的细胞系,作为双重稳定MSC细胞系;蛋白免疫印迹法观察该细胞系在Dox调控下AT2R表达的时相性、持续性及在不同浓度Dox调控下的表达情况;(4)建立大鼠颈动脉球囊损伤动物模型,将双重稳定MSC在术中导入血管,分别于14 d、28 d进行病理切片,检测可调控AT2R对新生内膜增生的影响;采用RT-PCR免疫组织化学免疫荧光等技术观察AT2R基因在新生内膜中的表达以及细胞外基质(ECM)成分表达的改变,TUNEL法检测血管组织中细胞凋亡的变化情况。研究结果:(1)免疫荧光显示共培养后MSC出现SM-α-actin、calponin及CD31阳性染色,电镜下可见肌丝状结构。单独培养及VSMC条件培养液培养的MSC仅SM-α-actin表达阳性;(2)Dox-on系统由四个质粒组成:调节质粒pUHD17-1 hyg,荧光报告质粒pUHC 13-3,筛选质粒pSV2neo以及含目的基因AT2R的应答质粒pUHD10-3/AT2R,以上质粒经鉴定均与其背景资料相符合,可用于实现目的基因片段在靶细胞中可调控表达研究;(3)本实验通过连续两个回合的转染及抗生素压力筛选,经Dox诱导表达后获取出低背景、高诱导表达AT2R基因的克隆。该MSC克隆受到Dox给予/去除的紧密调控,诱导后48 h就可使AT2R明显表达,在Dox干预72 h后AT2R表达进一步增强;Dox在一定的浓度范围(10-3ng/ml～104ng/ml)内呈剂量依赖性的增加该MSC细胞系中AT2R蛋白的诱导表达量,Dox浓度在102ng/ml～103ng/ml时达到峰值,更高浓度的Dox反而降低AT2R蛋白的表达;在转染后至少8w内,该MSC细胞系中AT2R蛋白均可以在Dox 1 ug/ml干预72 h后被显著诱导表达,强度不受时间延长的影响。(4)球囊损伤后14 d～28 d,新生内膜增生显著, MSC组和MSC转染组与对照组相比新生内膜无显著差异(P>0.05),而Dox组新生内膜面积显著下降(P<0.01);(5)免疫组织化学、免疫荧光及RT-PCR检测显示,各时相点Dox组较对照组、MSC组及MSC转染组AT2R表达显著增高(P<0.01);(6)血管损伤后MMP-2、LN、FN、OPN、COL-Ⅳ均出现显著增高表达,Dox组MMP-2、LN、FN、OPN的表达水平在术后14 d及28 d时均显著低于其它各损伤组(均P<0.05),COL-Ⅳ在术后14 d时高于其它各损伤组(P<0.05),28 d时各组间无差异(P>0.05);(7)血管损伤后新生内膜中出现凋亡细胞,其中Dox组细胞凋亡率显著高于对照组、MSC组及MSC转染组(P<0.05)。研究结论:(1)与VSMC直接接触可以诱导MSC向血管成分细胞分化;(2)构建的Dox-on可调控的MSC细胞株诱导活性可靠,使外源AT2R基因的表达处于有效的主动控制下;(3)局部导入MSC不影响球囊损伤后大鼠颈动脉新生内膜增生;(4)由MSC介导的AT2R可调控表达受到Dox的良好调控,可有效抑制球囊损伤后大鼠颈动脉新生内膜增生;(5)AT2R影响血管损伤后修复时ECM成分的表达,并促进细胞凋亡的发生,可能是AT2R介导抑制新生内膜形成的机制。