【摘 要】
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该研究通过扩增EBV-LMP1的cDNA,并利用杆状病毒昆虫系统在sf9细胞中表达LMP1.依据B95-8细胞来源EBV基因组中LMP1的基因序列,设计分别含BamH I和HindⅢ酶切位点的上下游特异性
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该研究通过扩增EBV-LMP1的cDNA,并利用杆状病毒昆虫系统在sf9细胞中表达LMP1.依据B95-8细胞来源EBV基因组中LMP1的基因序列,设计分别含BamH I和HindⅢ酶切位点的上下游特异性引物,通过逆转录PCR(RTPCR)技术扩增EBV-LMP1cDNA,产物经回收纯化后与pGEM-T easy载体进行T-A连接,转化JM109菌,提取质粒,限制性内切酶消化,琼脂糖凝胶电泳鉴定并送测序,结果所扩增的LMP1cDNA长度为1158bp,序列与B95-8细胞来源EBV基因组中LMP1的编码基因BNLF1的全外显子序列完全相符.将LMP1基因与线性化的pF<,AST>B<,AC>HTb进行连接,构建EBV-LMP1基因的杆状病毒重组供体质粒,将质粒pF<,AST>B<,AC>HTb-LMP1与DH10B<,AC>感受菌进行转座重组,通过三抗性培养基及蓝白斑筛选Bacmid/LMP1重组克隆,用M13正反向引物确认重组的发生,提取Bacmid/LMP1后,利用脂质体转染sf9昆虫细胞包装重组LMP1的杆状病毒,观察细胞病毒病变,用经扩增的病毒直接感染sf9细胞进行蛋白表达,通过免疫荧光、SDS-PAGE和Western-Blot检测表达情况,细胞能表达与LMP1单抗结合的蛋白,部分能直接分泌至细胞上清,分子量为63kD左右,表明LMP1基因能在昆虫细胞中获得良好表达.由于中国人群已普遍感染EBV,有对EB病毒特异性免疫的基础,希望将基因工程技术表达的EBV-LMP1蛋白制备成疫苗应用,激发机体对肿瘤细胞的特异性细胞免疫功能,可用于EBV-IgA/VCA抗体阳性者预防NPC发生,也可用于防止NPC病人治疗后的复发和转移.总之,该工作将为研究LMP1致瘤的分子机理及EB病毒相关肿瘤的治疗性疫苗奠定基础.
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