本试验通过克隆测序樱桃谷鸭和麻鸭CD8αORF基因,应用生物学软件进行预测分析得出樱桃谷鸭与人的CD8α胞外区的氨基酸相似形比较大。利用克隆表达技术对樱桃谷鸭的CD8α胞外区基因进行表达,制备兔抗樱桃谷鸭CD8α多克隆抗体,同时应用SABC免疫组化方法观测鸭的外周血的CD8+T细胞变化规律,为鸭细胞免疫方面的研究提供手段,其主要研究内容如下。1樱桃谷鸭和麻鸭CD8αORF的克隆测序及序列分析本试验通过对已公布北京鸭CD8α开放阅读框基因序列特征设计了一对特异性的引物,克隆了樱桃谷鸭和麻鸭CD8α基因,并公布了樱桃谷鸭和麻鸭的序列,其登录号分别为FJ527828和FJ528914。通过相关软件分析了不同种属动物其基因特征得出,樱桃谷鸭与麻鸭和北京鸭的CD8α氨基酸序列相互之间相似性差异最大的在胞外区,而其他区域相对保守；由以上分析结果,本人选取了差异性比较大的胞外区又进行了比较,发现樱桃谷鸭、麻鸭和人CD8α胞外区亲水性、抗原性以及该区域在蛋白质表面的功能都有明显差异。2樱桃谷鸭CD8α胞外区的原核表达由上面的基因比较之后,本人针对差异性比较大的胞外区,设计一对特异性的引物,用来克隆其区域基因。同时还对此基因序列构建了重组表达质粒pGEX-KG-DuCD8α,在E.coli BL21中通过对转化了重组质粒的基因进行诱导表达,对其表达产物进行SDS-PAGE电泳分析,在蛋白质电泳中43.8KDa位置处出现了明显的的蛋白条带；通过Western-blot分析在融合标签蛋白大约43.8Kda处有明显的抗原条带出现,证实本人对樱桃谷鸭CD8α胞外区多肽成功表达了。3抗樱桃谷鸭CD8α胞外区多克隆抗体的制备及初步应用对表达的包涵体蛋白进行纯化后作为免疫原,将与所获得的兔抗鸭免疫血清作为一抗,通过ELISA方法测定了兔抗rDuCD8α抗体效价为1：51200。在鸭瘟病毒感染后,非感染组CD8+T淋巴细胞数占淋巴细胞总数的百分比为29-32%,处于一个相对高的表达水平,而感染组CD8+T淋巴细胞百分比为10-21%,相对非感染组其表达水平较低,在感染后1到3天外周血液中CD8+T淋巴细胞比值缓慢下降,第3天以后比值缓慢上升,但表达水平都低于非感染组,另一个现象是,在部分嗜中性粒细胞细胞的表面免疫组化染色有阳性信号的出现。结果表明本研究成功表达CD8α胞外区多肽,制备的兔抗樱桃谷鸭CD8α多克隆抗体可用于检测鸭外周血中CD8+T淋巴细胞。