表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)是一种含有53个氨基酸的单链多肽,可有效地促进表皮细胞、成纤维细胞、角化细胞等多种细胞的增殖。因此,可作为化妆品添加剂及药物发挥皮肤修复、调养及去痘(去除粉刺、痊疮和青春痘)等功效。然而,作为一种生物大分子,透皮吸收差一直是困扰其实际应用的重大问题。细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPP)是一种能够携带蛋白质等多种外源性物质进入细胞的小分子多肽。为获得一种高透皮性、皮下靶向释放的hEGF,本课题利用基因工程的方法在EGF的N端引入细胞穿膜肽pep-1,并在二者间添加了皮下成纤维细胞高表达的金属机制蛋白酶(MMP)酶切位点。具体研究内容如下:首先利用PCR技术获得EGF、pep-1基因,然后通过重叠PCR技术将MMP-2的酶切位点编码基因插入于EGF和pep-1中间,以不同策略构建了 5个大肠杆菌表达质粒,转入大肠杆菌中后经比较确定最终筛选出最适工业化生产的表达体系为携带pET22b-PME质粒的E.coli BL21-TrixB(DE3),最佳诱导条件为含2%甘油的M9培养基;温度37℃、转速220 rpm、诱导剂IPTG浓度0.1 mM、诱导时机OD600≈1.0、时间10 h。超声裂解菌体后,利用Ni亲和层析方法从菌体总蛋白中富集变性的包涵体蛋白,然后采取尿素梯度透析的方法进行复性。经Western blot检测,纯化后获得的重组目的蛋白PME完全正确。免疫荧光及MTT分析显示重组PME具有很好的跨越角质细胞Hacat的能力,并能有效的促进Balb/c 3T3成纤维细胞的增殖。此外,本研究利用Transwell小室构建3D水平的离体模拟皮肤模型,经hEGF标准品验证该模型能够有效的模拟真实皮肤的生理学屏障作用,而本实验所构建表达的重组PME则能高效的跨越角质细胞层,并扩散作用于成纤维细胞中。最后,利用MMP-2金属基质蛋白酶在体外对PME进行了酶切实验分析。结果表明MMP-2可以对PME进行有效的切割,并且随着酶切时间的延长,酶切效率表现出一定的增强。此外,MMP-2酶切去除pep-1制备独立的hEGF的酶切条件为:在17.1μg目的蛋白中加入40 ng MMP-2金属基质蛋白酶,37℃酶切1 h。综上所述,本实验构建了一种具有高效跨膜转运与透皮吸收能力、并能实现皮下靶向释放的重组hEGF,建立了其大肠杆菌表达制备工艺,将有助于大大提高hEGF在药品及化妆品中的生物利用度及功效,从而为其相关产品的品质提升奠定了较好的基础