感染性疾病检测用DNA芯片的设计制作及其初步应用研究

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感染性疾病对人们的生命健康具有重大的危害,而对病原微生物的快速准确的检测则是感染性疾病的预防控制以及诊断治疗的关键。临床上急需一种快速、准确、简便并且能够同时检测多种不同病原或者同一病原的多项不同指标的检测方法。DNA芯片以其所具有的分析快速快、可并行处理、所需试剂及样品量少以及能够实现自动化的优势适应了这一需要。本文的目的是针对常规的感染性疾病检测方法以及已有的基于DNA芯片的研究和应用中所存在的问题,发展基于DNA芯片的感染性疾病检测系统以实现感染性疾病病原的同步快速检测;发展荧光标记检测的替代方式,减少对大型仪器的依赖,降低检测成本,提高芯片的实用性;研究芯片整合系统以实现PCR扩增,核酸杂交以及结果检测三个关键步骤的整合,从而减少操作,消除污染。基于这一目的,进行了四个方面的工作。1)建立了一套基于DNA芯片的感染性疾病病原同步检测的流程。基于该流程设计两类DNA芯片,分别针对血液相关的11种病毒(HAV、HBV、HCV、HDV、HEV、HGV、B19、TTV、EBV、HCMV以及HIV)以及血液质量控制四项(HBV、HCV、HIV以及TP)。临床实验的结果显示该芯片具有很好的特异性以及较高的检测灵敏度,能够进行多种病原的同步检测。从样品处理开始,整个检测过程可以在6小时~7小时内完成。2)建立了基于胶体金标记/银染放大法的DNA芯片结果检测方法。优化后的体系的检测灵敏度与Cy5荧光标记相当。将其与多重PCR相结合,成功地实现了三种重要的临床感染性病毒(HBV、HCV以及HIV)的同步芯片检测。3)建立了基于磁珠标记的DNA芯片结果检测方法。可在封闭的腔体内完成清洗和检测,清洗时间不超过2分钟,检测时间为20分钟~30分钟。对于寡核苷酸芯片,磁珠标记的检测灵敏度可以达到3.12nM,对于cDNA芯片,磁珠标记的检测灵敏度与Cy5荧光标记相当。将磁珠标记与多重PCR相结合,成功地实现了三种重要的临床感染性病毒(HBV、HCV以及HIV)的同步芯片检测。4)提出了Sampleindataout整合系统的概念,并通过实验初步实现了这一系统,即PCR、杂交以及检测在封闭腔体内的整合。首先建立了芯片PCR的条件,优化后的芯片PCR体系的扩增效果与常规PCR接近;其次,通过缓冲液的调整实现了PCR和杂交的整合,并通过不对称PCR进一步提高了杂交的效率;最终采用FRET探针实现了在封闭腔体内对杂交结果进行检测。
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