硼浓度对雏鸵鸟法氏囊形态结构及基因表达的影响

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非洲鸵鸟是世界上现存最大的鸟,它的免疫能力强,饲喂成本低,生长发育快,适应范围广,经济收益高。非洲鸵鸟在饲喂过程中,前3个月为育雏期,由于受到感染、疾病和应激等影响,育雏期鸵鸟的死亡率较高,最高有记录为50%。因此,降低育雏期鸵鸟的死亡率是鸵鸟养殖中迫切需要解决的问题。研究表明,育雏期鸵鸟的高死亡率与免疫功能发育不完善密切相关。法氏囊是鸟类特有的免疫器官,为B淋巴细胞发育的场所,其稳态的维持对免疫系统的正常发育具有重要意义。大量研究表明,硼参与调节动物的能量代谢、大脑功能、免疫功能及骨骼健康。然而,目前有关于硼对非洲鸵鸟法氏囊影响的研究报道还很少。因此,本项目以育雏期鸵鸟为试验动物,比较研究饮水中添加不同剂量的硼后,法氏囊形态结构及基因表达差异,为鸵鸟养殖生产中饮水硼的合理添加提供科学依据。主要研究工作和结果如下:1.不同浓度硼对育雏期鸵鸟体重的影响为了明确不同浓度硼对鸵鸟生长的影响,将1日龄48羽体重相近的鸵鸟适应性饲养1w后,随机分为3组,分别是对照组(饮水中添加0mg/L的硼酸)、低剂量组(饮水中添加80mg/L的硼酸)和高剂量组(饮水中添加640mg/L的硼酸)。饲养90d后,测量空腹体重。研究结果显示,低剂量组的体重显著高于高剂量组和对照组。以上研究结果表明,低剂量的硼促进鸵鸟的生长发育。2.不同浓度硼对雏鸵鸟法氏囊组织结构的影响为了比较不同浓度硼对法氏囊组织结构的影响,制作石蜡切片,并进行HE染色。研究结果显示,低剂量组法氏囊的皮质和髓质分层明显,细胞排列紧密,细胞数目多,细胞体积大,黏膜层增厚。高剂量组法氏囊的皮质与髓质之间没有明显区别,细胞排列疏松,外层皮质细胞数目明显减少。以上研究结果表明,低剂量饮水硼可促进鸵鸟法氏囊发育,高剂量饮水硼会抑制鸵鸟法氏囊发育。3.不同浓度硼对雏鸵鸟法氏囊内基因表达的影响为了探讨不同浓度硼对鸵鸟法氏囊中基因表达的影响,采用转录组测序技术,比较研究法氏囊中基因表达差异,并采用Q-PCR技术进行验证。研究结果显示,与对照组相比,低剂量组法氏囊中1449个基因上调表达,2017个基因下调表达;高剂量组法氏囊中1050个基因上调表达,2073个基因下调表达。在显著富集的基因中,与细胞凋亡相关的有,Bak、Bcl-、Faf1、Fadd、Edar、Mcl-1、Bmf、Rubcn、Card8。采用Q-PCR方法对测序中富集的基因Bak、Bcl-2、Edar、Fadd、Faf1、Mcl-1一共6个基因进行验证。Bak的基因表达在80 mg/L组内显著减少(p<0.0001),Bcl-2在80 mg/L组内显著上升(p<0.001),EDAR在80 mg/L中显著降低(p<0.01),在640mg/L组中显著上升(p<0.05);,FADD在80mg/L组中显著降低(p<0.0001),在640mg/L组中显著上升(p<0.0001);Faf1在80 mg/L组极显著下降(p<0.01);Mcl-1在80 mg/L组中明显升高(p>0.05)。荧光定量结果与测序结果说明,抑制凋亡的基因Bcl-2和Mcl-1在低剂量组显著升高,在高剂量组显著降低,促凋亡基因正好相反。4.不同浓度硼对雏鸵鸟法氏囊细胞凋亡及相关基因表达的影响为了比较不同浓度硼对鸵鸟法氏囊细胞凋亡的影响,采用TUNEL法检测凋亡细胞在不同组的分布,同时采用免疫组织化学染色技术比较研究了细胞凋亡相关蛋白在法氏囊中的表达差异。研究结果显示,低剂量组的凋亡细胞数量显著小于对照组(p<0.01),而高剂量组的凋亡细胞数量显著大于对照组(p<0.05)。Bak在80 mg/L组内显著减少(p<0.0001);Bcl-2在80 mg/L组表达显著增多(p<0.0001),在80 mg/L组内显著减少(p<0.001);EDAR在80 mg/L组内显著减少(p<0.05)在640mg/L显著增多(p<0.05);Fadd在80 mg/L组内显著减少(p<0.01),在640mg/L组内显著增多(p<0.05)。以上研究结果表明,低剂量硼能抑制细胞凋亡,高剂量硼能够促进细胞凋亡。综上所述,饮水中添加低剂量硼可显著促进鸵鸟生长发育,法氏囊内细胞数目更多,皮质内细胞排列更加紧密,发育情况好于对照组,抑制凋亡相关基因Bcl-2和Mcl-1在m RNA和蛋白的表达水平上显著高于对照组,促进凋亡基因Bak、Edar以及Fadd显著低于对照组,因此线粒体途径是低剂量硼控制凋亡的主要途径;高剂量组法氏囊内皮质与髓质之间没有明显区别,皮质细胞数目明显减少,发育被抑制,凋亡相关基因dar、Fadd显著增加,因此,高剂量硼通过多种途径促进细胞凋亡。
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