论文部分内容阅读
目的：1)通过检测结肠息肉、结肠腺瘤和结肠癌组织SH2-B表达,探讨SH2-B在结肠癌变过程中的演变规律。2)分析结肠癌临床分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期SH2-B表达,明确SH2-B表达与结肠癌临床分期的关系。3)分析结肠癌转移与无转移患者癌组织SH2-B表达,明确SH2-B表达与结肠癌转移的关系。4)通过基因转移将SH2-B表达载体导入低表达结肠癌细胞,分析细胞增殖和细胞周期,明确SH2-B介导细胞周期演进、促进细胞增殖。5)通过基因转移将SH2-B表达载体导入低表达结肠癌细胞,分析细胞侵袭和爬行运动,明确SH2-B介导细胞迁移、促进细胞侵袭转移。方法：1)免疫组织化学方法检测69例结肠癌组织、27例结肠腺瘤组织、29例结肠息肉组织SH2-B蛋白的表达,38例鼻咽癌组织作为对照,获得SH2-B在结肠癌变过程中的表达规律。2)免疫组化方法分析69例不同临床分期结肠癌患者SH2-B表达,其中Ⅰ期Ⅱ例、Ⅱ期22例、Ⅲ期19例、Ⅳ期17例,明确SH2-B表达与结肠癌临床分期的关系。3)免疫组化分析69例结肠癌患者,无转移34例,淋巴节转移35例,明确SH2-B表达与结肠癌转移的关系。4)用LipofecTAMINE2000将pcDNA3.1-SH2-B质粒转染至结肠癌细胞(HT-29),用Western-blotting分析转染SH2-B基因后SH2-B的表达；MTT法分析SH2-B对HT-29细胞增殖的影响；流式细胞术分析转染SH2-B后HT-29细胞周期变化。明确SH2-B是否增强细胞增殖而促进肿瘤发生、发展。5)用LipofecTAMINE 2000将pcDNA3.1-SH2-B质粒转染至结肠癌细胞HT-29,细胞划痕实验分析SH2-B对结肠癌细胞HT-29爬行运动的影响,用Boden Chamber分析SH2-B对结肠癌细胞HT-29侵袭运动的影响。结果：1)免疫组织化学检测结果显示,SH2-B蛋白在结肠息肉组织、结肠腺瘤组织、结肠癌组织的表达呈浆—核型,以胞浆为主。图像分析结果显示：结肠息肉患者SH2-B阳性率为31%(9/29),结肠腺瘤患者SH2-B阳性率为52%(14/27),结肠癌患者SH2-B阳性率为93%(27/29),肿瘤对照组鼻咽癌患者SH2-B阳性率为87%(33/38)。结肠癌组织中SH2-B的阳性细胞表达率(0.64±0.26)明显高于结肠腺瘤组织(0.26±0.27)和结肠息肉组织(0.12±0.21)(P<0.01),结肠腺瘤组织中阳性细胞表达率明显高于结肠息肉组织(P<0.05),结肠癌组织中SH2-B阳性细胞表达率(0.64±0.26)略高于鼻咽癌组织(0.49±0.28),(p<0.05)。SH2-B表达强度计分,结肠癌细胞2.76±1.18明显高于结肠腺瘤0.77±0.85和结肠息肉0.72±1.16(p<0.01),结肠腺瘤细胞与结肠息肉间无明显差异(P>0.05)；结肠癌2.76±1.18与鼻咽癌3.03±1.30之间无显著性差异(P>0.05),提示SH2-B在结肠癌变中可能具有重要作用。2)免疫组化结果显示,临床Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期结肠癌总阳性率分别为：90.9%(10/11),100%(22/22),100%(19/19),100%(17/17),各临床分期间SH2-B表达阳性率无显著差异。Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期强阳性率分别为18.2%(2/11),45.5%(10/22),57.9%(11/19),82.4%(14/17),Ⅳ期强阳性率高于Ⅲ期,Ⅲ期高于Ⅱ期,Ⅱ期高于Ⅰ期。明确SH2-B表达与结肠癌临床分期的关系。3)69例结肠癌中转移有35例,无转移有34例,转移组和无转移组SH2-B总阳性率分别为85.3%和100%,强阳性率为45.7%(16/35)和23.5%(8/34),转移组SH2-B强阳性率显著高于无转移组(p<0.05)。4)细胞增殖实验中,首先筛选SH2-B低表达结肠癌细胞系HT-29,将pcDNA3.1-SH2-B转染HT-29细胞,Western杂交检测SH2-B表达,结果表明：转染SH2-B基因后,SH2-B表达显著增加。MTT分析表明转染SH2-B基因后,HT-29细胞增殖显著增强(P<0.05)；结果提示SH2-B在结肠癌变过程中可能促进结肠上皮细胞异常增殖。流式细胞仪检测结果显示,转染SH2-B组S期细胞为(39.4±2.31)%,显著高于未转染组(18.6±4.25)%和空载体组(11.1±2.39)%。表明SH2-B促进结肠癌细胞周期S期演进。5)细胞划痕实验,SH2-B转染组、未转染组和空载体转染组爬行细胞数,倒置显微镜10个视野为867±187,349±121,279±158,转染SH2-B组爬行细胞数显著高于未转染组和空载体转染组。Trans-well实验结果：转染SH2-B组、未转染组和空载体转染组穿过滤膜细胞数分别为278±107,112±81和129±88,转染SH2-B组透过细胞数显著高于未转染组和空载体转染组。表明SH2-B促进和增强结肠癌细胞侵袭运动。结论：1) SH2-B在结肠息肉、结肠腺瘤和结肠癌组织中表达逐步增强,推断SH2-B过表达可能参与了结肠癌癌变过程,是结肠癌变的早期事件。SH2-B可能在结肠癌变早期发挥重要作用。2)SH2-B强阳性表达,在结肠癌临床分期临床Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期中逐步升高,表明SH2-B表达与结肠癌临床分期有关。3)转移组结肠癌SH2-B强阳性表达高于无转移组,表明SH2-B可能参与了结肠癌细胞转移。4)MTT结果显示,转染SH2-B组结肠癌细胞HT-29增殖快于未转染组和空载体转染对照组,提示SH2-B促进结肠癌细胞增殖。流式细胞仪检测结果显示,转染SH2-B组细胞S期细胞高于未转染组和空载体转染对照组,提示SH2-B促进细胞周期演进。5)细胞划痕实验结果表明,转染SH2-B组爬行细胞数明显高于未转染组和空载体转染对照组,提示SH2-B促进细胞爬行运动。Trans-Well实验表明,转染SH2-B组侵袭细胞数明显高于未转染组和空载体转染对照组,提示SH2-B过表达可能促进结肠癌细胞的侵袭和转移。