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目的:制备具有低免疫原性的去细胞化猪肝脏组织材料,探讨经交联剂京尼平修饰的去细胞化猪肝脏组织材料的免疫原性,为进一步利用去细胞化肝脏生物支架材料重建肝脏器官并实现临床异体移植奠定实验基础。方法:①去细胞化猪肝脏组织材料的制备及其修饰:1).随机选取体重为12-15kg雄性巴马小型猪4只,将其深度麻醉,取其完整肝脏,并随机选取其中3个肝脏,经门静脉插管后,以1%SDS+1%Triton X-100方案灌注对完整猪肝脏进行去细胞化处理,制成去细胞化的猪肝脏生物组织材料;另一只未经去细胞化的猪肝脏作为对照组。对去细胞组及未去细胞组材料进行病理切片并用苏木精和伊红染色(H&E),Masson’s trichrome染色,免疫组织化学染色,DNA含量分析及PCR检测抗原基因表达以评价去细胞化效果。2).将去细胞化的猪肝脏组织材料切成直径约为1.5cm的方形块,并将其随机分为三组(每组约30块),其中两组分别给予浓度为0.625%的京尼平(GP)和浓度为的0.625%戊二醛(GA)进行交联,另一只未去细胞肝脏亦切成相同大小方形块,作为对照组。然后对各组材料(GP修饰去细胞组,GA修饰去细胞组,未修饰去细胞组及未去细胞组)进行形态学观察,病理切片H&E染色检测其显微结构及细胞成分清除情况,并且通过电子显微镜观察各组细胞外基质三维立体结构。②去细胞化及去细胞化后修饰的肝脏组织材料体外诱导单核细胞迁移及异体植入大鼠皮下局部反应实验:1).以u-937人单核细胞系进行体外迁移实验,运用碾磨器碾磨材料并高速离心方法分别提取gp修饰去细胞组,ga修饰去细胞组,未修饰去细胞组及未去细胞组的猪肝脏组织材料中的蛋白,利用带有pet膜的六孔板行体外迁移试验检测人单核细胞分别对各组蛋白提取物的迁移反应。2).将各组已经切好的等体积小块组织材料分别植入sd大鼠皮下,并分别于植入后第3,7,14及28天取出植入的材料及其周围包裹组织,进行病理切片及h&e染色,并在高倍视野下对材料周围浸润的粒细胞/淋巴细胞及单核巨噬细胞分别进行记数,检测材料组织在动物体内的免疫排斥反应。结果:①去细胞化及交联修饰后的检测:1).h&e及masson’strichrome染色显示去细胞化的肝脏组织材料中细胞成分被清除干净,并保留了原组织的细胞外基质三维立体结构,该三维立体结构成分包括胶原蛋白、弹性蛋白和硫酸粘多糖(gags)等成分;琼脂糖凝胶电泳显示去细胞化后的肝脏组织材料中未观察到dna残留片段,pcr表明组织中的α-1,3半乳糖-β-1,4半乳糖-n-乙酰氨基葡萄糖抗原、猪白细胞抗原(sla)、猪内源性逆转录病毒(perv)等与免疫反应有关的成分均被清除;免疫组化提示细胞外基质特定位置的gal抗原表位明显减少。2).经京尼平和戊二醛交联后的去细胞化肝脏组织材料外观分别表现为深蓝色和褐色,体积较前有所变小,质地变硬。经修饰后材料的h&e染色显示去细胞化肝脏组织材料仍未见细胞成分残留,并且未改变其细胞外基质的三维立体支架结构;扫描电镜(sem)观察到去细胞化的肝脏组织材料表现出较未去细胞化的肝脏组织材料更丰富的相互交联的多孔结构,经京尼平及戊二醛交联并不会影响其多孔性。②免疫原性检测:1).体外人单核细胞迁移实现表明GP修饰去细胞组,GA修饰去细胞组,未修饰去细胞组及未去细胞组的猪肝脏组织材料提取蛋白分别作为迁移实验底物时,分别有(34.67±4.33)×103,(31.67±2.906)×103,(64.33±6.936)×103,(108.8±15.33)×103个U-937细胞自由迁移到下腔室,对比未去细胞的肝脏组织提取蛋白,去细胞后的肝脏组织材料提取物能明显的降低人单核细胞迁移率(P<0.05),且经交联剂修饰后能进一步降低迁移率(P<0.05)。2).将材料植入大鼠皮下,并定时将材料及其周围包裹组织取出行病理切片及H&E染色提示,植入后第3天,未去细胞组及未修饰去细胞组肝脏组织材料即出现明显的急性炎症排斥反应,并于植后第14天材料明显变薄,第28天均被降解吸收;经GA交联修饰后的肝脏组织材料于植入后第28天可见炎性细胞的浸润包裹,出现了免疫反应,无明显降解;然而,在整个观察期间,经京尼平修饰后的材料组只见少许炎性细胞浸润包裹。结论:①.1%SDS+1%Triton X-100灌注方案能有效地清除掉完整猪肝脏组织器官中的细胞及抗原成分。?.交联剂GP及GA均不会改变去细胞化猪肝脏组织材料的多孔性及三维立体结构。?.交联剂京尼平能有效的降低去细胞化猪肝脏组织材料的免疫原性。