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鸡传染性喉气管炎（Infectious laryngotracheitis,ILT）和鸡痘（Fowlpox）是目前影响养鸡业的两种重要传染病,造成的经济损失巨大。为有效防控这两种疫病,基于鸡痘病毒严格的宿主特异性,基因组庞大,存在大量的复制非必需区,适合做病毒载体等特性,实验室前期构建表达了鸡传染性喉气管炎病毒流行株的主要保护性抗原gB基因的重组鸡痘病毒基因工程疫苗rFPV-ILTV gB,并对其免疫效力、理化特性、生物安全性等特性进行了初步探究。本研究将对rFPV-ILTV gB在不同条件下免疫SPF鸡和商品鸡的安全性和免疫效力进行系统性的评价,为该疫苗候选株后续的临床试验和生产提供数据支撑。1 rFPV-ILTV gB安全性评价为评价疫苗候选株的安全性。本研究使用蚀斑计数法测定了不同病毒感染复数（Multiplicity of infection,MOI）的 rFPV-ILTV gB 接种于鸡胚成纤维细胞（Chicken embryofibroblast,CEF）后的生长曲线;根据测得的最佳MOI和收毒时间点制备了 rFPV-ILTV gB基础种子批;真空冷冻干燥后对其性状、支原体、外源病毒、细菌、真空度和剩余水分等项目进行了检验。21日龄SPF鸡和海兰褐蛋鸡分别刺种免疫2×104 PFU/3 μL的rFPV-ILTV gB、野生鸡痘病毒wt-FPV282E4、商品化鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗Cr-FPV和PBS,通过观察症状和病变,记录体重增长情况进行疫苗安全性评价;以同样方法评价了 rFPV-ILTV gB在SPF鸡上重复接种、超剂量接种、非临床使用日龄接种的安全性。结果表明,冻干的基础种子批各指标均符合《中国兽药典》标准;rFPV-ILTV gB刺种免疫后,SPF鸡和海兰褐蛋鸡局部产生轻微结痂,并很快消退,无全身反应,生长发育和增重均不受影响;以各种不同使用条件和剂量免疫SPF鸡后同样安全,SPF鸡的饮食欲和生长增重均不受影响。2 FPV和ILTV攻毒模型建立为了建立鸡痘病毒（FPV）102株和1370株的攻毒模型,将49日龄SPF鸡随机分成9组,其中6组分别以羽毛囊涂抹法攻毒102、103、104 EID50/0.1 mL的FPV 102株和FPV 1370株,2组分别以刺种攻毒103 EID50/3 μL的FPV 102和FPV 1370,剩余1组为PBS对照组。攻毒后观察临床症状,确定鸡痘的最小感染剂量。为了建立传染性喉气管炎病毒（ILTV）攻毒模型,将49日龄SPF鸡随机分为7组,其中6组分别以102、103、104 EID50/0.1 mL的剂量以喉内滴注法攻毒ILTV 119株和ILTV WG株,剩余1组为PBS对照组。攻毒后结合临床症状和剖检病变,确定传染性喉气管炎的最小感染剂量。结果表明,FPV 102株和FPV 1370的最小感染剂量均为103 EID50/0.1 mL,潜伏期分别为6 d和9 d,最佳攻毒方式均为羽毛囊涂抹;ILTV 119和ILTV WG的最小感染剂量均为104 EID50/0.1 mL,潜伏期分别为3d和4 d。本研究建立了可靠的FPV和ILTV攻毒模型,为评价表达rFPV-ILTV gB的免疫效力奠定基础。3 rFPV-ILTV gB免疫效力评价3.1 rFPV-ILTV gB的最小免疫剂量为了进一步评价rFPV-ILTV gB的免疫效力,测定其最小免疫剂量,21日龄SPF鸡以不同剂量免疫rFPV-ILTV gB后,分别使用ILTV I19和FPV 102进行攻毒保护试验。结果表明,最小免疫剂量为104 PFU/3 μL。3.2 rFPV-ILTV gB在SPF鸡上的免疫效力将使用剂量定为2×104PFU/3 μL,分别用 rFPV-ILTV gB、Cr-FPV、wt-FPV282E4、PBS免疫21日龄SPF鸡,免疫后28d用ILTVI19和FPV 102攻毒,评价各组免疫效力。自免疫当日起每周采血,用间接ELISA方法检测免疫后鸡体内分别针对ILTV和FPV的抗体水平。结果显示,免疫后rFPV-ILTV gB组的ILTV和FPV抗体水平均为四组中最高,ILTV抗体水平于免疫后28d达到峰值（0.583±0.449 OD450）,FPV抗体水平于免疫后21d达到峰值（0.639±0.106 OD450）。攻毒后,各组SPF鸡体内针对ILTV和FPV的抗体均迅速上升。rFPV-ILTV gB组、Cr-FPV组、wt-FPV282E4组、PBS组对ILTV I19的攻毒保护率分别为90%、80%、0%、0%、,对FPV 102的攻毒保护率分别为90%、70%、80%、0%。3.3 rFPV-ILTV gB接种SPF鸡后的免疫产生期及免疫持续期为了探究rFPV-ILTV gB的免疫持续期,于免疫后不同时间点进行攻毒保护试验。结果表明,rFPV-ILTV gB免疫后21 d时对ILTV和FPV 102的保护率分别为60%和70%;免疫后28 d时保护率分别为100%和90%。初次免疫50 d后以相同剂量进行二次免疫,二免后56 d时对ILTV 119和FPV 102的保护率为90%和100%。3.4 rFPV-ILTV gB在商品蛋鸡上的免疫效力海兰褐蛋鸡自7日龄起,每周采集血清检测体内的ILTV和FPV抗体水平;21日龄时分别用rFPV-ILTV gB、Cr-FPV、wt-FPV282E4、PBS进行刺种免疫,免疫后7 d和14 d采集脾脏,qRT-PCR检测细胞因子IL-2、IL-18和IFN-γ的相对转录水平;免疫后28 d分别用ILTV 119和FPV 102攻毒,评价各疫苗株的免疫效力。间接ELISA结果表明,7日龄时海兰褐蛋鸡体内的ILTV和FPV母源抗体水平分别为0.699±0.182 OD450和0.328±0.103 OD450,随着日龄增长逐渐衰减,21日龄时降至0.312±0.093 OD450和0.151±0.033 OD450。免疫后再次上升,rFPV-ILTV gB组的ILTV抗体水平于免疫后28 d达到峰值（0.670±0.088 OD450）,FPV抗体水平于免疫后21d达到峰值（0.868±0.119OD450）。免疫后14d,rFPV-ILTV gB诱导产生的细胞因子转录水平在各免疫组中最高;rFPV-ILTV gB、Cr-FPV、wt-FPV282E4、PBS 对 ILTV I19 的攻毒保护率分别为 100%、90%、60%和 70%,对 FPV 102 的攻毒保护率分别为100%、50%、100%和0%。3.5 rFPV-ILTV gB在非临床使用日龄商品蛋鸡上的免疫效力15日龄海兰褐蛋鸡免疫rFPV-ILTV gB,免疫28 d后分别进行ILTV 119和FPV 102攻毒试验,结果显示,ILTV 119攻毒后免疫组攻毒保护率为80%,对照组未发病,表明15日龄商品鸡免疫时存在ILTV母源抗体的干扰;FPV 102攻毒后免疫组保护率为100%,对照组全部发病。初次免疫后50 d二次免疫rFPV-ILTV gB,其后28 d进行攻毒保护试验,经ILTV 119和FPV 102攻击后的保护率均为100%。综上所述,rFPV-ILTV gB对SPF鸡和商品蛋鸡均表现出良好的安全性和免疫效力,能够作为防控鸡传染性喉气管炎和鸡痘的疫苗候选株。