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产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是创伤性气性坏疽和人类食物中毒以及动物坏死性肠炎、肠毒血症的主要病原菌之一。产气荚膜梭菌主要的致病因子是其分泌的外毒素,种类多达13种,其中α、β、ε和t是最主要的外毒素,根据产生外毒素的种类不同,可分为A、B、C、D和E5个血清型,其中α毒素(C. perfringens alpha toxin, CPA)是各型产气荚膜梭菌产生的共同毒力因子,也是A型菌产生的最主要毒素,不仅能破坏细胞膜的完整性,导致细胞裂解,而且具有细胞毒性、溶血性、致死性和皮肤坏死性等特性。β2毒素(C.perfringens beta2toxin, cpb2),是由B型和C型菌产生的一种强毒素,作为C型产气荚膜梭菌主要毒力因子之一,具有细胞毒性和致死性,可产生溶血性坏死和坏死性肠炎,该型病菌可引发多种畜禽的肠炎和肠毒血症。ε毒素由B型和D型产气荚膜梭菌产生的毒素,是D型菌的主要毒素。β1毒素是一种坏死性和致死性毒素,它们是引起仔猪红痢的主要致病因子,该病具有很高的发病率和死亡率。为有效预防由多型产气荚膜梭菌所引起的疾病,制备多种毒素的免疫原,抵抗异源毒素的攻击,对预防该病的发生具有实际意义。为研究α-β2-ε-β1融合蛋白的免疫原性,本研究选择大肠杆菌BL21(DE3)作为抗原递呈载体,利用本实验室构建的重组质粒pET-30b-α-β2克隆α-β2毒素片段(其中a毒素编码的第68位组氨酸残基突变成甘氨酸残基,β2毒素编码的第234位半胱氨酸残基突变成甘氨酸残基),利用重组质粒pET-28α-ε克隆￡毒素片段(第106位组氨酸突变成脯氨酸),通过PCR方法从C型产气荚膜梭菌全基因组上克隆β1基因,然后将α-β2-ε-β1融合基因亚克隆到pProHTa表达载体中,转化到大肠杆菌BL21(DE3),重组质粒命名为pProHTa-α-β2-ε-β1,重组大肠杆菌命名为pProHTa-α-β2-ε-β1/BL21(DE3)。将重组大肠杆菌诱导表达,结果表明α-β2-ε-β1融合蛋白以包涵体形式表达,表达蛋白占菌体总蛋白的18.4%。通过腹腔注射免疫6-8周龄BALB/c小鼠,测定血清抗体的中和活性,并分别用A型和B型产气荚膜梭菌强毒株进行攻毒试验,结果表明,免疫鼠对A型产气荚膜梭菌强毒株1LDloo和2LD100的攻毒保护率分别为100%和60%,对B型产气荚膜梭菌强毒株1LD100和2LD100的攻毒保护率分别为100%和80%。以上研究证实,α-β2-ε-β1融合蛋白可作为产气荚膜梭菌基因工程疫苗的有效组分。本研究进一步以干酪乳杆菌Lactobacillus casei ATCC393(L. casei393)作为递呈抗原的载体,构建产气荚膜梭菌α-β2-ε-β1毒素的重组干酪乳酸杆菌系统。重组质粒命名为pPG-2-α--β2-ε-β1,重组干酪乳杆菌命名为pPG-2-α-β2-ε-β1/L. casei393。将重组干酪乳杆菌以1%乳糖为诱导剂进行诱导表达,SDS-PAGE检测结果表明,表达的融合蛋白为126ku,大小与理论值相符。Western blot分析表明,表达蛋白可被A型产气荚膜梭菌α毒素抗血清所识别,具有良好的特异性。为探讨重组干酪乳杆菌系统递呈特异性抗原诱导免疫应答的水平,本研究以BALB/c小鼠为试验动物进行免疫,免疫程序为：第一组口服接种200μ LpPG-2-α-β2-ε-β1/L. casei393(109CFU/mL)活菌量,每隔2w免疫一次,共免疫三次,每次连续免疫3d,一天免疫一次。第二组口服接种pPG-2/L. casei393109CFU/mL活菌,每隔2w免疫一次,共免疫三次,每次连续免疫3d,一天免疫一次,阴性对照组小鼠口服PBS. ELISA检测结果表明,免疫后分别测定小鼠粪便sIgA中含量最高、其次是阴道粘液和泪液样品。同时在小鼠血清中亦检测到了较高水平的特异性IgG,随着免疫次数的增加而升高。第三次免疫10天后对免疫鼠进行毒素攻毒实验,试验结果表明免疫鼠产生的抗体能够抵抗A型和B型产气荚膜梭菌分泌的天然毒素对小鼠的攻击。综上,本研究构建了重组大肠杆菌pProHTa-a-p2-ε-β1/BL-21(DE3)及重组干酪乳杆菌重组干酪乳杆菌表达系统免疫小鼠后,既可诱导局部免疫应答,又可刺激机体产生系统的体液免疫应答,产生的特pPG-2-a-p2-ε-β1/L.casei393,特异性抗体对小鼠具有良好的免疫保护作用。以上结果表明,重组干酪乳杆菌表达系统作为口服疫苗具有潜在的应用价值,为下一步探索新型产气荚膜梭菌口服疫苗的研制奠定了基础。