甲状腺功能亢进症(Hyperthyroidism,简称甲亢),是一种常见的内分泌系统疾病,常累及全身多系统、多器官,其中常见而又往往易被忽视的是肝脏损害。甲亢性肝损害的发病率高达37%～76.7%,相当多的甲亢患者伴有肝脏损害,引起肝功能异常、肝肿大,黄疸等。肝脏是人体重要的代谢器官,肝损害引起肝细胞损害、再生、肝纤维化,并可以发展为肝硬化、肝功能衰竭。因此,关于肝损害机制及对其保护和治疗药物的研究就显得非常迫切,已经引起许多学者的关注,成为目前国内外研究的热点与难点课题。甲亢性肝损害的治疗,多以控制甲亢临床症状为主,而保肝、降酶,避免肝脏进一步损害的治疗药物较少。因此,我们试图研究既抗甲亢又保肝的中药制剂以填补其空白。因宁片是南方医院运用益气养阴软坚散结原理组成的,既治疗甲亢,控制甲亢症状和体征,尤其是治疗或减少甲亢并发症、降低副作用、减少甲亢复发方面具有明显优势,又有保肝作用的中药制剂。实验室前期研究证明因宁片能明显降低大鼠血液中甲状腺激素含量、延长甲亢小鼠耐缺氧时间、提高小鼠非特异性免疫功能,但因宁片治疗甲亢防治肝损害的作用机制尚不清楚,有待进一步研究。因此,本课题通过动物和细胞实验,从受体和细胞水平,探讨因宁片治疗甲亢性肝损害的分子作用机制,为药物开发和临床应用提供实验依据。第一章因宁片对甲亢性肝损害大鼠模型的实验研究目的：观察因宁片对甲亢性肝损害大鼠模型的作用,检测血清中甲状腺激素水平、肝功能、氧化应激参数的变化,观察肝脏病理组织学改变,探讨氧化应激对甲亢性肝损害的影响,为进一步研究药物作用机制提供实验依据。方法：选用SD雌性大鼠60只,随机分为6组,除空白对照组外,其余大鼠给L-甲状腺素钠800μg/(kg·d)灌胃30 d,制备甲亢性肝损害模型。大鼠造模成功后给予因宁片低(0.6g/(kg·d))、中(1.2g/(kg·d))、高(2.4g/(kg·d))剂量,甲亢灵(1.2g/(kg·d))灌胃治疗30 d,处死大鼠后收集血样和肝组织,采用放射免疫法测定血清中三碘甲腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、促甲状腺激素(TSH)含量,全自动生化分析仪检测丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)水平,分光光度法测定肝组织匀浆中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、还原型谷胱甘肽(GSH)值和Na+-K+-ATP酶活性。取肝脏进行光镜和电镜观察。结果：(1)血清中T3、T4、TSH值的变化：与空白对照组比较,模型组大鼠血清中T3、T4显著升高,TSH显著降低(P<0.01)。因宁片低、中、高剂量组与模型组比较均显著降低T3、T4含量、升高TSH含量(P<0.05,P<0.01)。(2)血清中AST、ALYT、ALP含量的变化：与空白对照组比较,模型组大鼠血清AST、ALT、ALP含量显著升高(P<0.01)。因宁片低、中、高剂量组与模型组比较均能显著降低AST、ALT含量(P<0.05,P<0.01),因宁片高剂量组能降低ALP水平(P<0.05),而因宁片低、中剂量组ALP水平无显著性改变(P>0.05)。(3)肝组织MDA、SOD、GSH、Px、CAT、GSH值和Na+-K+-ATP酶活性的变化：模型组肝脏氧化应激指标中：MDA增加(P<0.01)；SOD、CAT、GSH-Px、Na+-K+ATP酶活性降低,GSH含量下降,与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05)。与模型组比较,因宁片治疗后,MDA含量降低,呈现剂量依赖性(r=0.449,P<0.01)；因宁片低剂量升高SOD酶活性作用与因宁片中、高剂量比较有显著性差异(P<0.01),但因宁片中剂量和高剂量比较差异无统计学意义(P>0.05)；因宁片低剂量升高CAT酶活性与高剂量组比较有显著性差异(P<0.05),而与中剂量比较差异无统计学意义(P>0.05)；因宁片升高GSH-Px、Na+-K+-ATP酶活性,增加GSH含量(P<0.05),因宁片各剂量组之间无显著性差异。(4)肝脏光镜和电镜病理组织学改变：模型组大鼠肝细胞出现不同程度的脂肪变性、炎性细胞浸润、线粒体数量增多、嵴消失等；因宁片各治疗组能不同程度改善肝脏病理学变化：糖原颗粒明显增多、线粒体数量减少、肿胀减轻、体积减小。结论：因宁片对L-甲状腺素钠诱发的大鼠甲亢性肝损害有明显保护作用,能降低模型大鼠血液中甲状腺激素水平,降低转氨酶含量,改善肝脏病理损害,抑制肝脏氧化应激反应。第二章因宁片对甲亢性肝损害大鼠肝脏的甲状腺激素受体、Ⅰ型脱碘酶和细胞色素P4so基因表达的影响目的：运用实时荧光定量PCR方法检测因宁片治疗大鼠甲亢性肝损害后,肝脏的甲状腺激素受体(TR)、Ⅰ型脱碘酶(DioI)和细胞色素P450(CYP450)基因表达的变化。方法：利用雌性大鼠灌服L-甲状腺素钠建立甲亢性肝损害大鼠模型。以甲亢灵为阳性对照药,因宁片低、中、高剂量治疗30d,取部分肝脏通过实时荧光定量PCR方法检测肝组织内TRα1、TRα2、TRβ1、DioI、CYP1A2、CYP2E1、CYP3A2基因转录水平的变化。结果：(1)肝组织TRα1、TRα2、TRβ1表达变化：与空白对照组比较,模型组TRα1表达上调,TRα2表达下调,TRβ1表达上调(P<0.01)；因宁片能降低TRa1和TRβ1基因表达(P<0.05),对TRα2表达影响不明显(P>0.05)。(2)肝组织DioI表达变化：模型组DioI表达与空白对照组相比显著增强(P<0.01),因宁片能降低DioI表达,并呈剂量依赖趋势(r=-0.792,P(3)肝组织CYP1A2、CYP2E1、CYP3A2表达变化：与空白对照组比较,模型组CYP1A2和CYP3A2表达下降(P<0.01,P<0.05),而CYP2E1表达升高(P<0.01)；因宁片能降低CYP2E1的表达(P<0.05),但对CYP1A2和CYP3A2的表达无明显影响(P>0.05)。结论：因宁片能调节甲亢大鼠肝脏TR、Diol和CYP450基因的异常表达,这可能是因宁片治疗甲亢性肝损害的分子作用机制之-第三章因宁片对甲亢性肝损害大鼠肝细胞凋亡的影响目的：观察因宁片对甲亢大鼠肝细胞凋亡调节蛋白Fas、Fas配体(FasL)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、半胱天冬酶-3(Caspase-3)和B细胞白血病-淋巴瘤-2(Bcl-2)表达的影响,探讨因宁片对甲亢性肝损害的保护作用及其机制。方法：利用雌性大鼠灌服L-甲状腺素钠建立甲亢性肝损害动物模型。以甲亢灵为阳性对照药,因宁片低、中、高剂量组治疗30d,取部分肝脏,采用免疫组化技术检测各组大鼠肝脏中Fas、FasL、TNF-α的表达,Western-Blot检测Caspase-3、Bcl-2蛋白表达。结果：(1)肝脏中Fas、FasL、TNF-α表达变化：Fas、FasL免疫反应阳性产物呈棕黄色,主要表达于细胞浆中,TNF-α免疫反应阳性产物呈棕黄色,主要表达于细胞浆,细胞膜和炎细胞中；空白对照组有散在少量表达,模型组表达明显增高,范围增大,两者比较有非常显著性差异(P<0.01)。同模型组比较,因宁片中、高剂量组能下调Fas、FasL、TNF-α表达(P<0.05)。(2)肝脏中Caspase-3和Bcl-2蛋白表达变化：与空白对照组比较,模型组Caspase-3蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达下降(P<0.01),因宁片低、中、高剂量组能降低Caspase-3蛋白表达、升高Bcl-2蛋白表达,与模型组比较有非常显著性差异(P<0.01)。结论：Fas、FasL、TNF-α、Caspase-3和Bcl-2在甲亢性肝损害大鼠的肝脏中表达异常,因宁片防治甲亢性肝损害的作用可能与抑制细胞凋亡有关。第四章因宁片减轻T3诱导BRL肝细胞损害的体外实验研究目的：观察因宁片对T3诱导后BRL肝细胞的增值、肝功能和氧化应激的影响,为进一步阐明药物作用机制提供实验依据。方法：(1)药物血清的制备：25只雌性SD大鼠,随机分为5组：空白对照组,因宁片低、中、高剂量组,甲亢灵组。大鼠灌服相应剂量的药物后,腹腔静脉采血,分离药物血清。(2)因宁片对T3诱导BRL肝细胞损害的影响：建立大鼠肝细胞T3损害模型,在不同浓度因宁片药物血清作用下,应用MTT法测定药物作用后细胞存活率的变化,全自动生化分析仪测定培养上清液中AST、ALT的含量,分光光度法测定细胞内MDA、SOD值。结果：(1) BRL细胞存活率的变化：随着因宁片血药浓度升高,T3损害后的BRL细胞存活率逐渐增加；因宁片低剂量组与中剂量组比较有显著性差异(P<0.05),高剂量组和中剂量组比较有升高趋势但无统计学差异(P>0.05)。(2) BRL细胞培养上清液中ALT、AST含量的变化：与模型组比较,因宁片能显著减少ALT、AST的释放(P<0.05),因宁片中剂量组和低剂量组比较差异有统计学意义(P<0.05),因宁片高剂量组与因宁片中剂量组比较有降低趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。(3)BRL细胞内MDA、SOD含量的变化：模型组BRL细胞混悬液中的MDA含量显著升高,SOD活性显著降低,和空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,甲亢灵组和因宁片中、高剂量组均能明显降低MDA含量(P<0.05),因宁片低、中、高剂量组能显著提高SOD活性(P<0.05,P<0.01)。结论：因宁片的药物血清对T3诱导BRL肝细胞损害有保护作用,提高T3损害后的BRL细胞存活率,降低细胞培养上清液中转氨酶含量,减轻肝细胞氧化应激损害。