急性肾损伤是一组以突发和持续的肾功能下降为特征的临床综合症,是引起继发性慢性肾脏病、肾衰竭及住院患者死亡的重要原因。其病理过程主要包括肾小管上皮细胞发生炎症、凋亡甚至是坏死等。前期的研究发现,顺铂诱导的急性肾损伤中存在ROS水平的变化,其来源存在多种途径,其中NADPH oxidases的过度激活是氧化应激水平升高的重要机制。NADPH oxidases是一个包含膜结合细胞色素b558和细胞溶质调节蛋白的多组分酶。在肾脏组织中主要存在Nox4亚型的表达,并且Nox4在肾脏疾病中的作用受到广泛关注,例如,Nox4参与糖尿病肾病、肾肿瘤等肾脏疾病的发生发展。然而目前关于Nox4在顺铂诱导的急性肾损伤中的功能尚未见报道。本课题分别设计体内与体外实验,研究在顺铂诱导的急性肾损伤中,Nox4的作用及可能涉及的调控机制,为防止急性肾损伤寻找新的策略。本课题的主要研究内容包括以下几个部分:1.体外实验,用NAC预处理HK2细胞,检测NAC抑制顺铂诱导的KIM-1蛋白与mRNA、相关炎症因子mRNA水平以及RIP-mediated necroptosis和凋亡相关蛋白的表达体外实验以HK2细胞为研究对象,实验分为三组:正常组;模型组用Cisplatin(20uM)处理细胞24h;NAC组用NAC(50u M)预处理12h,然后给予顺铂刺激24h。分别提取各组细胞的蛋白与RNA,通过Western blot、Real-time PCR、免疫荧光和流式细胞术方法,检测ROS与肾损伤程度相关指标的水平。结果表明,顺铂促进ROS表达的上调。同时,抑制ROS可以减轻顺铂诱导的肾损伤程度。提示ROS参与顺铂诱导的急性肾损伤过程。2.在体内外实验中,NADPH oxidases阻断剂apocynin抑制顺铂诱导的KIM-1蛋白与mRNA、相关炎症因子mRNA水平以及降低RIP-mediated necroptosis和凋亡相关蛋白的表达1)体外实验以HK2细胞为研究对象,实验分为三组:正常组;模型组使用Cisplatin(20u M)刺激细胞24h;Apo组先用apocynin(100u M)预处理12h后,给予顺铂刺激24h。通过Western blot、Real-time PCR、免疫荧光和流式细胞术方法检测相关指标水平。结果表明,apocynin显著地抑制顺铂诱导的肾损伤因子(KIM-1)的蛋白与RNA水平;同时降低顺铂引起的肾小管上皮细胞的凋亡与坏死;而且抑制RIP-mediated necroptosis相关蛋白(RIP1/RIP3/P-MLKL)和凋亡相关蛋白(cleaved-caspase3)水平,并且抑制了炎症相关因子(TNF-α/IL-1β/IL-6/MCP-1)的mRNA水平。提示NADPH oxidases参与顺铂诱导的急性肾损伤过程。2)体内实验,将小鼠分为正常组、Cisplatin组、Cispaltin+apocynin组,每组8只小鼠,正常组小鼠腹腔注射等体积的生理盐水;Cisplatin组小鼠腹腔注射顺铂(20mg/kg),建立急性肾损伤模型;Cisplatin+apocynin组小鼠腹腔注射apocynin(100mg/kg),第二天给小鼠腹腔注射顺铂(20mg/kg)。腹腔注射顺铂3天后处死小鼠采集血样与收集肾组织,通过病理学、血清学、Western blot与Real-time PCR等方法检测其相关指标。结果发现,与正常组相比,Cispaltin组病理学、血清学、Western blot、Real-time PCR等方法检测指标均显著增高;与Cisplatin组相比,Cisplatin+apocynin组病理学、血清学、Western blot、Real-time PCR等方法检测的指标均显著降低,提示apocynin可以减轻顺铂诱导的急性肾损伤模型肾脏的损伤程度。3.在体内外实验中,Nox4促进顺铂诱导的KIM-1蛋白与mRNA、相关炎症因子mRNA水平以及RIP-mediated necroptosis和凋亡相关蛋白的表达1)在体外实验中,与正常组相比,cisplatin刺激的HK2细胞组,显著上调Nox4蛋白与mRNA水平;在体内实验中,给小鼠腹腔注射顺铂(20mg/kg),建立急性肾损伤模型,三天后处死小鼠,通过IHC、Western blot和Real-time PCR方法发现,与正常组小鼠相比,模型组小鼠的肾脏组织中,存在Nox4蛋白与mRNA水平的高表达。因此,本课题着眼于NADPH oxidases家族中Nox4在顺铂诱导的急性肾损伤中的研究。2)在HK2细胞上,用shRNA干扰技术靶向沉默Nox4,用顺铂(20uM)刺激HK2细胞,结果发现,沉默Nox4可以显著抑制顺铂诱导的KIM-1蛋白与mRNA水平,另外沉默Nox4可以抑制顺铂诱导的RIP-mediated necroptosis相关蛋白RIP1/RIP3/P-MLKL以及凋亡相关蛋白cleaved-caspase3的表达,同时也显著降低炎症因子TNF-α、IL-1β与IL-8的水平。提示,Nox4通过RIP-mediated necroptosis、凋亡与炎症机制影响顺铂诱导的急性肾损伤过程。3)在HK2细胞上,转染Nox4质粒,用顺铂(20u M)刺激HK2细胞,结果发现,过表达Nox4可以促进顺铂诱导的KIM-1蛋白与mRNA水平,另外过表达Nox4可以促进顺铂诱导的RIP-mediated necroptosis相关蛋白RIP1/RIP3/P-MLKL以及凋亡相关蛋白cleaved-caspase3的表达,同时也可以显著促进炎症因子TNF-α、IL-1β与IL-8的水平。提示,Nox4通过RIP-mediated necroptosis、凋亡及炎症机制促进顺铂诱导的急性肾损伤过程。4.在Nox4过表达细胞株上,ROS阻断剂NAC抑制Nox4促进顺铂诱导KIM-1蛋白与mRNA、相关炎症因子mRNA水平以及RIP-mediated necroptosis和凋亡相关蛋白的表达在Nox4过表达的细胞株上,给予NAC(50u M)预处理12h,随后给予顺铂(20u M)刺激24h,实验被分为六组分别为Control组;Nox4 OE组;Control+Cispaltin组;Nox4OE+Cispaltin组;Control+Cispaltin+NAC组;Nox4 OE+Cispaltin+NAC组。通过Westrn blot与Real-time PCR方法检测相关指标。结果发现,NAC抑制Nox4对顺铂诱导的急性肾损伤的促进作用。提示,Nox4可能是通过ROS介导的RIP-mediated necroptosis、凋亡及炎症机制促进顺铂诱导的急性肾损伤过程。5.给小鼠尾静脉注射慢病毒包装的Nox4 sh RNA,在体沉默Nox4减轻顺铂诱导的小鼠功能与组织的损伤以及降低RIP-mediated necroptosis和凋亡相关蛋白的表达小鼠被随机分为六组:Normal组;Vector组;Nox4 KD组;Normal+Cisplatin组;Vector+Cisplatin组;Nox4 KD+Cisplatin组;通过尾静脉给Nox4 KD和Nox4KD+Cisplatin组的小鼠注射慢病毒包装的Nox4 sh RNA,一周后,给对应模型组的小鼠腹腔注射顺铂(20mg/kg),建立急性肾损伤模型。三天后处死各组小鼠,取血样和肾脏组织,通过组织学、血清学、Western blot和Real-time PCR等方法检测相关指标。与Normal+Cisplatin组或Vector+Cisplatin组相比,Nox4 KD组中的PAS染色、KIM-1的蛋白与mRNA水平、RIP-mediated necroptosis相关蛋白、凋亡相关蛋白的水平以及炎症相关指标的水平均明显降低,且差异存在统计学意义。提示,在体沉默Nox4可以降低顺铂诱导的急性肾损伤过程,即Nox4可能作为顺铂诱导的急性肾损伤的治疗靶点。6.在肿瘤细胞上沉默Nox4不影响肿瘤细胞对肿瘤的治疗作用在体外,建立Nox4沉默肿瘤细胞株(包括BEL7401,SGC-7901,C6细胞)。结果发现,沉默Nox4可以明显抑制肿瘤细胞的增殖;同时在顺铂刺激24h后,沉默Nox4可以轻度地增加细胞对顺铂的敏感性;在顺铂刺激48h时,沉默Nox4不影响肿瘤细胞对顺铂的敏感性。综上述所,沉默Nox4在不影响顺铂抗肿瘤作用的同时,可以降低顺铂引起的急性肾损伤作用。这为防治肿瘤合并急性肾损伤患者提供了新思路。