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目的:应用荧光标记复合扩增技术检测短串联重复序列(short tandemrepeats,STR)遗传标记已经成为法医学亲权鉴定与个人识别的重要手段。目前,国内外法医DNA实验室应用的商品化STR复合分型试剂盒主要包括美国ABI公司的IdentifilerTM试剂盒和Promega公司PowerPlex(R)16 System试剂盒,基本能够满足大部分个体识别和三联体亲子鉴定案件的检验。但对于二联体单亲鉴定或其它一些疑难的亲缘关系鉴定,二者的系统效能不能满足其鉴定要求。因此,用于二联体亲子鉴定的试剂盒有待进一步完善。本研究根据文献报道选出在中国汉族人群多态性良好的8个新的STR基因,包括D7S3048、D8S1132、D11S2368、D2S1772、D6S1043、D13S325、D12S391、GATA198B05,将其构建成STR荧光标记复合分型体系,对该体系的灵敏度及种属特异性进行测试,并利用该分型体系调查中国汉族、土族、回族、藏族群体遗传学参数,将该体系与IdentifilerTM试剂盒或PowerPlex(R)16试剂盒联合用于单亲鉴定,评价该分型体系在单亲鉴定中的应用价值。
方法:采用Chelex-100法提取无关健康个体FTA血卡DNA。利用荧光复合扩增技术,构建包括Amelogenin、D8S1132、D12S391、GATA198B05、D7S3048、D2S1772、D11S2368、D6S1043、D13S325基因座的复合扩增体系。将Amelogenin、D8S1132、D12S391三个基因座的上游引物5端用6-FAM荧光标记,GATA198805、D7S3048两个基因座的上游引物5端用HEX荧光标记,D2S1772、D11S2368两个基因座的上游引物5端用TAMRA荧光标记,D6S1043、D13S325两个基因座的上游引物5端用ROX荧光标记。调节各基因座引物浓度、Mg2+浓度、Taq酶浓度、退火温度、循环次数、预变性时间、延伸时间等条件对复合体系进行优化,得到最佳的反应条件。应用ABI310及ABI3130基因自动分析仪对扩增产物进行检测,Genemapper3.2软件分析结果、对样本进行检测分型。每个基因座选取2个纯合子进行测序,依据测序结果并根据国际法医遗传学会(international society of forensic genetics,ISFG)推荐的命名原则对各等位基因进行命名。利用该体系调查回族、土族、藏族各100个无关健康个体及200个汉族无关健康个体的遗传学数据。分别计算各基因座的等位基因频率及各法医学参数,并比较不同人群的等位基因分布情况。对该荧光标记复合扩增体系的灵敏度、种属特异性进行研究。选取本法医鉴定中心既往积累的单亲鉴定的案例10例,应用本系统与商品化试剂盒联合检测,计算父权指数、评价该系统在单亲鉴定中的应用价值。
结果:
1复合扩增体系的建立:成功构建包含8个STR基因座和1个牙釉质蛋白基因座的复合扩增体系。9个基因座都获得了清晰的基因型分型结果,无干扰分型的非特异性扩增产物,可实现准确分型。
2群体遗传学调查结果:应用该体系对回族、土族、藏族各100例及汉族无关健康个体200例进行群体遗传学调查,基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。在中国汉族、藏族、土族、回族人群,8个基因座的杂合度观察值(Ho)的范围分别为0.803～0.905、0.778～0.872、0.720～0.900、0.816～0.889;多态性信息含量(PIC)的范围分别为0.770～0860、0.750～0.860、0.750～0.860、0.750～0.860;非父排除概率(PE)的范围分别为0.605～0.806、0.558～0.739、0.460～0.795、0.630～0.773;个人识别率(DP)的范围分别为0.927～0.967、0.906～0.964、0.913～963、0.909～0.964;匹配概率(Pm)的范围分别为0.033～0.073、0.036～0.094、0.037～0.087、0.036～0.091;累积个人识别率分别为0.99999999998、0.99999999996、0.99999999996、0.99999999996;累积非父排除率分别为0.99989、0.99993、0.9998、0.99993。
3法医学应用评估:
3.1系统灵敏度研究结果:在DNA含量为0.125ng时,应用STR复合扩增系统仍可以进行正确分型。
3.2种属特异性研究结果:在所检测的非灵长类动物(狗、兔、牛、鱼、猪、鸡)灵长类动物(猴)及实验室常见的菌株(念珠菌、肠球菌、大肠杆菌)中,除猴在牙釉质蛋白基因座出现产物峰外,其余样本的所有9个基因座均无特异性产物峰出现。
3.3在单亲鉴定案件中,联合应用本系统和IdentifilerTM试剂盒或与PowerPlex(R)16 System,二者的累积二联体非父排除概率均达到0.9999以上,并使累积父权指数提高2～4个数量级,大大提高了单亲鉴定结论的可靠性。
结论:本研究构建了包括D8S1132、D12S391、GATA198B05、D7S3048、D2S1772、D11S2368、D6S1043、D13S325八个STR基因座和1个牙釉质蛋白基因座在内的荧光标记复合扩增体系,分型结果准确、稳定可靠,灵敏度达0.125ng,具有人类种属特异性,在中国回族、藏族、土族及汉族群体中具有较好的遗传多态性,补充了少数民族的遗传学数据,可作为常规STR试剂盒的有益补充,提高系统效能,更好地解决单亲鉴定及疑难亲子鉴定案件。