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全球环境日益恶化,一些非生物胁迫(如干旱,低温,高温,盐渍化等)严重地影响农作物的生长发育,导致粮食产量和品质下降。为此,致力于发掘作物抗逆相关的新基因,并将之运用到作物抗性品种的筛选与改良上,成了当今一个研究热点之一。
近年来,随着分子生物学理论和技术的发展,抗逆研究取得了很大进步,许多抗逆基因已被分离,而且还发现了很多与已知抗逆基因相互作用的蛋白质。之前,我们用FDD技术并结合大矩阵方法从水稻中筛选了很多逆境相关基因,并发现水稻热激蛋白OsHsp90在各种逆境下可以被诱导。通过酵母双杂交分析,我们发现了多个与OsHsp90结合的蛋白。我们尤其对多逆境反应的OsPRP-like基因感兴趣,以期运用分子生物学技术深入探究其生理机制、逆境表达调控机理等,为最终运用到作物品种选育、粮食生产方面打下基础。
本文在前人的研究基础上,着重以OsPRP-like为研究对象。主要研究结果如下:
1.运用酵母双杂技术,以OsHsp90为诱饵蛋白,从水稻低温/干旱cDNA文库中筛选出5个结合蛋白的cDNA:(1)其中有两个经测序比对发现是编码同一蛋白的富脯氨酸聚集蛋白OsPRP(rice proline rich protein)与细胞壁发育相关;(2)RBBI3-3,一个蛋白酶抑制剂;(3)P450,与细胞色素相关;(4)含ZIM domain,与植物转录因子相关的未知基因。
2.通过AD与BD载体互换验证试验,得出OsPRP-like与OsHsp90真实结合,再过把OsPRP-like的不同部位构建到BD载体中,结果显示脯氨酸富集区域结合能力最强,且与OsHsp90的C端结合。
3.利用RT-PCR技术,我们克隆得到OsPRP-like基因。该基因全长1686bp,89-1339bp为ORF,推测编码一个416个AA残基的蛋白质,分子量预测为46.5 kD,命名为OsPRP-like。功能预测主要聚集在第54-412 AA的PEPK富集区。
4.利用半定量和实时荧光定量PCR技术,我们发现OsPRP-like在低温,高温,干旱,盐渍胁迫下,反应敏感;与OsHsp90结果比较发现OsPRP-like可能是触发OsHsp90基因启动表达的一个先导体,当然它自身也可能独立应答逆境伤害。另外,在水稻不同生育时期,OsPRP-like基因也表现很特异的表达模式,推测它可能参与生长发育调节和逆境信号传递。