近年来,基于免疫检查点细胞程序性死亡受体1（Programmed cell death protein 1,PD-1）/程序性死亡配体1（Programmed cell death Ligand 1,PD-L1）的抗肿瘤治疗策略在多种恶性肿瘤的临床治疗实践中取得了突破性进展。其中单克隆抗体PD-1/PD-L1阻断剂药物在相关的肿瘤治疗中疗效显著,但是其具有实体瘤组织渗透性差、制备成本高等缺陷,并且在治疗过程中容易产生过敏、心脏毒性等严重的不良反应。因此,纳米抗体作为传统单克隆抗体的重要补充,逐渐被广泛应用于相关新药的开发和研究。与传统单克隆抗体及相关抗体衍生物相比,纳米抗体具有分子量小、组织穿透能力强、易表达、耐修饰等很多独特的理化和药理性质。然而,其缺点也不容忽视。例如,纳米抗体缺乏传统抗体的Fc区域,因此不能介导Fc依赖性的抗肿瘤免疫效应;此外,纳米抗体由于自身体积小,导致其一般具有很短的血液半衰期。由于纳米抗体对化学修饰、体外酶法修饰以及基因融合等各种蛋白质修饰具有很强的耐受性,因此可以通过添加功能模块调节其药理性质。鉴于此,本研究拟通过2,4-二硝基苯（DNP）半抗原模块化修饰PD-L1纳米抗体,期望利用DNP模块的抗体招募功能间接赋予纳米抗体Fc相关免疫学功能。本研究以已报道的PD-L1纳米抗体KN035为研究对象,通过Sortase A（Srt A）酶介导的偶联反应对其进行半抗原DNP定点修饰,利用流式细胞术、免疫印迹、免疫荧光等实验对所得耦合物的亲和力、特异性、抗体招募能力进行表征,并对产物的构效关系进行研究。最后,通过体外抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）和补体依赖的细胞毒作用（Complement-dependent cytotoxicity,CDC）实验对耦合物介导的免疫杀伤活性和抗肿瘤活性进行了表征,并通过测定其血清半衰期初步评价耦合物在体内的药代动力学。该策略在保留了KN035作为PD-L1特异性阻断剂作用的同时,引入了额外的肿瘤免疫杀伤机制,预期可以显著增加其抗肿瘤活性。主要结论如下:（1）成功构建了含有Sortag、Myc以及6×His融合标签的KN035-MSH表达载体p ET22b-KN035-MSH,并通过原核表达系统获得纳米抗体KN035-MSH,经纯化脱盐其产量可达到12 mg×L-1。（2）通过Srt A酶介导的连接反应,将三个分别具有1,3,6个聚乙二醇（Poly ethylene glycol,PEG）连接子的DNP定点修饰至纳米抗体KN035-MSH的C端,最终成功获得三种DNP与KN035-MSH的耦合物KNPn（n=1,3,6）。（3）流式细胞术对耦合物亲和力和特异性的分析表明,KN035-MSH的C末端DNP定点修饰并没有对其靶向性带来不良影响,所有耦合物保持和亲本纳米抗体KN035-MSH一样的特异性和亲和力。（4）流式细胞术、免疫荧光等实验分析表明,所有耦合物都能够特异性地将抗DNP抗体募集到肿瘤细胞表面,且其中含有3个PEG连接子的KNP3耦合物具有最强的抗DNP抗体招募能力。（5）体外肿瘤杀伤实验表明,在抗DNP抗体存在的条件下,所有耦合物均可通过招募抗DNP抗体发挥ADCC和CDC活性,并对PD-L1抗原表达的肿瘤细胞产生杀伤作用,其中KNP3展现出最高的肿瘤杀伤率,ADCC和CDC活性均达到30%。（6）体内药代动力学实验表明,在预免疫OVA-DNP的小鼠中,KNP3耦合物的血清停留时间得到了显著延长,半衰期达到了21.49 h,是相同条件下未修饰纳米抗体的69倍。