家蚕细小病毒样病毒(Bombyx mori Parvo-like virus,BmDLV)原称为家蚕浓核病毒Ⅱ型(Bombyx mori Densovirus typeⅡ,BmDNV-Ⅱ),是首例动物二分病毒,它是引起家蚕浓核症的重要病原微生物之一。它与家蚕浓核病毒(BmDNV-Ⅰ)一样,都感染家蚕的中肠组织圆筒形细胞,病毒粒子无囊膜,基因组都为单链线性的DNA并且都含末端重复序列。不同的是,该病毒的基因组分为两个单链DNA分子(VD1,6.6 kb；VD2,6.1 kb)且分别独立包装在不同的衣壳中；两条链的末端重复序列中无回文序列；并且含有自身编码的DNA聚合酶；该病毒的复制机制还未知。为了进一步了解该病毒的特性,本研究构建了家蚕细小病毒样病毒中国镇江株(BmPLV-Z)的基因组克隆及含报告基因eGFP的重组质粒,并对克隆质粒的感染性进行了鉴定；另外,对病毒基因编码的非结构蛋白NS2进行了序列分析及细胞定位鉴定。　　 本研究中,主要对BmPLN-Z进行了以下四方面的研究:(1)克隆病毒的基因组,构建稳定增殖的VD1和VD2基因组克隆质粒,并绘制BmPLV-Z基因组的结构图；(2)检测克隆质粒在BmN细胞和家蚕幼虫中的复制及其感染性；(3)构建带有报告基因eGFP的重组质粒,转染BmN和Sf9细胞,并检测重组质粒的复制和病毒基因的表达；(4)分析病毒非结构蛋白2(NS2)序列特征,并通过瞬时表达和免疫荧光检测NS2在BmN细胞中的定位。　　 1家蚕细小病毒样病毒中国镇江株基因组克隆的构建及基因组结构图的绘制　　 根据病毒基因组末端序列特征,设计带唯一酶切位点的引物,以裂解的病毒粒子作模板进行基因组全长PCR扩增。VD1全长克隆pT-VD1,经全长引物一次PCR扩增产物克隆获得；VD2全长克隆pUC-VD2,则由基因组中的SacⅠ酶切位点分两段扩增、克隆,拼接重构形成完整基因组全长克隆。对克隆质粒的稳定传代和保存作了培养菌种和温度的筛选,建立了稳定繁殖和保存质粒的方法；对克隆基因组进行测序和结构分析,绘制了较完善的病毒基因组结构图。　　 2基因组克隆的转染及其感染性鉴定　　 脂质体包埋基因组克隆转染BmN细胞和家蚕幼虫,对克隆基因组的复制及感染性进行检测。转染的细胞无形态变化,家蚕幼虫也正常生长；收集转染后96 h的细胞和家蚕中肠组织,对其DNA和cDNA进行PCR鉴定,结果未检测到病毒基因组的复制。　　 3重组质粒pVD1-VPGFP和pVD1-AVPGFP的构建　　 将基因组克隆pT-VD1用作载体,在vp基因后面插入报告基因eGFP和用eGFP替换vp基因进行重组质粒的构建；将重组质粒转染Sf9和BmN细胞进行基因复制与表达检测。通过上述实验,成功地构建了两个含报告基因的重组质粒pVD1-VPGFP和pVD1-ΔVPGFP,并间接地检测了病毒基因组克隆在细胞中的复制和表达。　　 4 BmPLV-Z-NS2的序列分析及细胞定位　　 非结构蛋白NS2是由VD1-ORF1编码的。生物信息学分析表明BmPLV-Z-NS2与细小病毒的NS2无同源性,而与染色体复制起始蛋白dnaA和DNA-binding反应调节子有一定的同源性。NS2含有1个天冬酰胺-N-糖基化位点、3个酪蛋白激酶C磷酸化位点和3个蛋白激酶C磷酸化位点等可能的功能位点。这些结构特征显示NS2可能是一个多功能蛋白。基因转录分析表明NS2在病毒感染的初期表达量低而后期表达量升高。通过构建的瞬时表达质粒pFastBacHTb-ie1p-ns2,转染BmN细胞,用anti-NS2多克隆抗体进行免疫荧光检测,结果显示在72 h NS2定位于核膜附近,而96 h时则完全定位于的核膜。综合所得结果,NS2含有糖基化位点、感染初期表达量低而末期表达量高,定位于核膜,这些特性都与腺病毒的死亡蛋白ADP相似。