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研究背景：在冠心病(CHD)的治疗过程中,无论是经皮冠脉介入治疗(PCI)还是冠脉旁路移植术(CABG),其疗效都受到再狭窄(restenosis)的威胁。冠脉术后再狭窄是一个非常复杂的过程,有多种细胞、因子参与其中。近年来,人们发现血管外膜成纤维细胞(AF)在再狭窄形成过程中起到重要的作用。AF在多种因素刺激下发生表型转化是其参与再狭窄过程的关键。虽然具体分子机制目前仍不完全清楚,TGFβ1仍被认为是诱导AF发生表型转化的最重要的刺激因子,是构建AF表型转化模型的主要工具。目前已有研究发现NADPH氧化酶4(NOX4)在心血管系统中存在显著表达,并通过产生活性氧族(ROS)参与多种细胞内生理,病理过程。但NOX4是否参与AF表型转化过程及其分子机制是什么目前仍未不清楚。本研究旨在探讨NOX4在AF表型转化过程中的作用以及可能的分子机制。为成功防治冠脉术后再狭窄提供新的靶点。第一部分大鼠胸主动脉血管外膜成纤维细胞培养目的：获得可用于进一步实验研究的原代血管外膜成纤维细胞方法：购买自武汉大学实验动物中心SD大鼠经断颈处死后在无菌条件下剪取胸主动脉,剥取外膜剪成1mmx1mm大小组织块,进行贴块法培养。所获取的细胞进行免疫组化鉴别。对于分选出来的AF进行传代,冻存以备下一步实验。结果：应用大鼠胸主动脉外膜组织块贴块法进行原代细胞培养,所获得的细胞呈梭形或三角形,经过免疫组化鉴定发现细胞内a-SMA表达呈阴性,波形蛋白表达呈阳性。该细胞符合成纤维细胞特征,可以确定为血管外膜成纤维细胞。细胞生长状况良好。经3次传代后,细胞可以达到足够纯度用于进一步实验。结论：应用大鼠胸主动脉外膜组织块贴块法成功获得血管外膜成纤维细胞。经3次传代后,细胞可以达到足够纯度用于进一步实验。第二部分NOX4表达在血管外膜成纤维细胞表型转化中的作用目的：因为NOX4在心血管系统中存在重要的作用,所以在本部分中我们以NOX4为靶点,探索其在血管外膜成纤维细胞表型转化过程中的作用。方法：取4-8代处于生长对数期的AF,无血清培养基同步化12h后分别构建空白组细胞,TGFβ1组细胞和TGFβ1+siRNA组细胞。空白组细胞：以含2%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养24h；TGFβ1组细胞：以含2%胎牛血清的高糖DMEM培养基+TGFβ11Ong/ml培养24h；TGFβ1+siRNA组细胞：应用Lipo2000成功转染NOX4siRNA后,以含2%胎牛血清的高糖DMEM培养基+TGFβ1lOng/ml培养24h；免疫荧光法初步检测NOX4表达变化；Western blotting, PCR检测NOX4和a-SMA表达情况；Transwell检测12h,24h的细胞迁移情况。结果：(1)TGFβ1组与空白组相比,细胞内NOX4的表达明显增加(Western blotting:0.796±0.0616比0.531±0.0444,P<0.05；PCR：0.7293±0.05280比0.2470±0.01659,P<0.05)。应用NOX4siRNA后,NOX4的表达明显减弱(Western blotting:0.420±0.0279比0.796±0.0616,P<0.05；PCR：0.2081±0.02166比0.7293±0.05280,P<0.05)。(2)空白组无a-SMA表达,TGFβ1组a-SMA表达增加,转染NOX4siRNA后细胞内a-SMA表达明显较TGFβ1组减少(Western blotting:0.3647±0.06642比0.6352+0.09138,P<0.05；PCR：0.3375±0.04136比0.5400±0.03158,P<0.05)。(3)TGFβ1组细胞迁移较空白组明显增强(12h：20.600±1.5166比3.800±0.8367,P<0.05;24h：50.800±2.5884比11.400±1.3416,P<0.05),转染NOX4siRNA后细胞迁移受到抑制(12h：7.000±0.7071比20.600±1.5166,P<0.05；24h：20.400±1.8166比50.800±2.5884,P<0.05)。结论：(1)AF表型转化过程中NOX4表达明显增加,细胞迁移明显增强。(2)抑制NOX4活性后,AF表型转化过程受到抑制,细胞迁移减弱。第三部分NOX4调节血管外膜成纤维细胞表型转化的相关机制目的：我们已经在上部分的实验中确定NOX4在AF表型转化过程中存在重要作用。在本部分中,我们进一步探索NOX4调节血管外膜成纤维细胞表型转化的相关机制。方法：取4-8代处于生长对数期的AF,无血清培养基同步化12h。ROS抑制剂NAC, MEK抑制剂U0126预处理AF后,观察其对TGFβl诱导的AF表型转化过程中α-SMA表达的影响,并检测下游信号蛋白MEK1/2, ERK1/2的磷酸化水平。结果：(1)NAC预处理细胞后,AF表型转化受到明显抑制(Western blotting:0.2332±0.01294比0.4700±0.06351,P<0.05；PCR：0.1959±0.01940比0.4642±0.03505, P<0.05), MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平明显降低(p-MEK1/2:0.4342±0.02450比0.6748±0.03225, P<O.05)(p-ERKl/2:2.2359±0.1069比4.9034±0.35521,P<0.05)。(2)U0126预处理细胞后,AF表型转化受到明显抑制(Western blotting:0.2337±0.01166比0.4334±0.05675, P<0.05; PCR:0.1468±0.02986比0.3968±0.06183,P<0.05),ERK1/2的磷酸化水平显著降低(2.9315±0.41269比7.0608±0.45744,P<0.05)。结论：(1)抑制ROS活性可以抑制AF发生表型转化,降低细胞内MEK-ERK通路的磷酸化水平。(2)阻断MEK-ERK通路可以抑制AF发生表型转化。(3)NOX4通过调控ROS-MEK-ERK通路调节AF表型转化。