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研究背景和目的:炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)是一种非特异性炎症性疾病,与自身免疫异常有关,是西方国家常见的消化系统疾病,在普通人群中的发病率接近0.2%。近年来,随着生活方式的西化,我国IBD的发病率明显上升,特别是在北京、上海等经济发达地区,IBD的发病率已逐渐接近欧美国家水平,其中溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)的发病率要明显高于克罗恩病(Crohn’s Disease,CD),在我国两者的发病率接近10:1。IBD作为一组特发性慢性肠道炎性疾病,目前多进行对症性治疗,暂无根治手段,临床表现差异性较大,易复发,并发症较重,肠外表现复杂多样。研究表明接近30-60%的IBD患者在疾病发展过程中必须接受外科治疗,患者生活质量受到极大影响,而且,IBD已成为中国下消化道大出血最常见的病因之一,严重影响患者的生命安全。另外,IBD还存在一定的癌变风险,因此IBD一直是消化系统疾病的研究热点之一。目前,IBD的确切病因尚不清楚,但基础和临床研究均提示肠道内环境稳态的破坏及肠道微生物引发异常炎症反应在IBD发病中具有重要作用,长期的慢性炎症状态可能是炎症因子过度分泌或者关键负性调节途径缺陷的结果。在生理情况下,Paneth细胞主要分布于小肠,可分泌大量抗菌颗粒,抵抗肠道微生物的侵袭,是肠道天然免疫的重要效应器。在慢性炎症状态下,结肠可出现Paneth细胞化生,但是结肠化生的Paneth细胞功能的相关研究极少,Paneth细胞在IBD发病中的作用机制尚值得进一步探讨。最新研究证据表明,白介素23(IL-23)/Th17途径是肠道炎症反应的关键因素之一,肠道炎症时IL-23在肠道的表达远远高于其在全身的表达,具有明显的组织特异性,因此IL-23在IBD发生发展的过程中扮演着重要的角色。而研究发现TLR4通路参与调控IL-23/Th17轴的活化过程,而Paneth细胞又可表达TLR,因此,Paneth细胞通过TLR4通路进而调控IL-23/Th17轴可能是其参与IBD发生发展的重要机制之一,本研究通过对人体标本的检测及动物实验验证这一假说,以进一步明确炎症性肠病的发病机制。实验方法:第一部分:内镜下采集溃疡性结肠炎患者病变结肠组织并进行免疫组化检测,以进一步明确Paneth细胞化生及TLR4表达与IBD发生的相关性。并对标本量充足的溃疡性结肠炎病变结肠组织进行体外培养,检测其中IL23、IL17等炎症因子水平,评估其在IBD发生过程中所发挥的重要作用及其是否与Paneth细胞化生及TLR4表达升高存在相关性。第二部分:建造DSS小鼠炎症性肠病模型,通过观察其体重变化、饮食、大便性状、大便潜血等进行病情活动度评分,并采集新鲜病变标本,通过HE染色、免疫组化检测、RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)、酶联免疫吸附实验(ELISA)等方法检测IBD组织中Paneth细胞化生、TLR4及IL23、IL17等表达的变化,以探讨上述因素在IBD发病过程中的作用。第三部分:建立炎症性肠病小鼠模型,并给予TLR4激动剂LPS,进行病情活动度评分,并采集新鲜病变标本,通过HE染色、免疫组化检测、RT-PCR及ELISA等方法检测小鼠结肠组织中Paneth细胞化生、TLR4及IL23、IL17等表达的变化,进一步明确TLR4在炎症性肠病发生和进展中的作用。另外,通过给予TLR4阻断剂TAK242,观察是否可以减轻炎症性肠病小鼠的病情及上述指标的异常程度,反向证实TLR4对炎症性肠病发生发展的重要影响。第四部分:通过使用Paneth细胞特异性速效阻断剂双硫腙在体阻断炎症性肠病动物模型的Paneth细胞,以进一步明确其在炎症性肠病发病过程中的重要作用和诊断价值,并初步探讨其对TLR4信号通路的调控作用及这种调控作用对IL23/Th17轴在炎症性肠病发生过程中作用的影响。实验结果:第一部分:溃疡性结肠炎患者病变结肠组织存在明显的Paneth细胞化生和TLR4通路高表达,且二者之间存在相关性。溃疡性结肠炎患者病变结肠组织存在明显的IL23/Th17轴的活化。溃疡性结肠炎患者病变结肠组织Paneth细胞化生和TLR4通路高表达与IL23/Th 17轴的活化存在明显相关性。第二部分:DSS诱导的炎症性肠病小鼠症状、病理及MPO活性改变等类似人炎症性肠病表现。DSS诱导的炎症性肠病小鼠病变结肠部位出现明显的Paneth细胞化生及TLR4表达升高,炎症因子IL23、IL17和IL6的分泌水平亦明显升高,提示上述因素可能与炎症性肠病的发生密切相关。第三部分:给予TLR4激活剂LPS,炎症性肠病小鼠病情加重,DAI评分升高,病变结肠MPO活性明显升高,并出现明显的Paneth细胞化生及TLR4表达升高。炎症因子IL23、IL17和IL6的分泌水平明显高于普通模型组。给予TLR4阻断剂TAK242,炎症性肠病小鼠病情减轻,DAI评分降低,病变结肠MPO活性亦明显降低,炎症因子IL23、IL17和IL6的分泌水平低于普通模型组。上述结果从正反两个方向提示TLR4通路可能通过调控IL23/Th17轴的活化进而在炎症性肠病的发生发展中发挥重要作用。另外,给予TLR4阻断剂后,在Paneth细胞化生仍然存在的情况下,DSS诱导的炎症性肠病小鼠病情减轻,提示Paneth细胞化生在炎症性肠病发生发展的重要作用可能主要是通过TLR4通路来实现的。第四部分:给予Paneth细胞阻断剂双硫腙,炎症性肠病小鼠病情减轻,DAI评分降低,病变结肠MPO活性明显下降,TLR4表达亦有明显下降。炎症因子IL23、IL17和IL6的分泌水平明显低于普通模型组。给予Paneth细胞阻断剂双硫腙后,即使再次给予TLR4激活剂LPS,炎症性肠病小鼠病情也明显轻于DL组,甚至普通模型组,DAI评分降低,病变结肠MPO活性亦明显降低,炎症因子IL23、IL17和IL6的分泌水平低于DL组。上述结果从正反两个方向提示Paneth细胞化生在炎症性肠病发生发展过程中发挥重要作用,化生Paneth细胞可能通过TLR4通路调控IL23/Th17轴进而影响炎症性肠病进展。结论:本研究通过对炎症性肠病患者病变结肠组织的检测及对炎症性肠病动物模型的干预发现炎症性肠病组织存在明显的Paneth细胞化生和TLR4通路高表达与IL23/Th17轴的活化,且三者之间存在明显相关性;化生Paneth细胞可能通过TLR4通路调控IL23/Th17轴的活化水平进而影响炎症性肠病进展。