洋桔梗[Eustoma grandiflorum(Raf.)Shinn.],又名草原龙胆,为一、二年生草本观赏植物,是世界上十分流行的盆花和切花种类之一,具有很高的观赏价值和商业价值。然而,自从洋桔梗在全世界范围内大面积引种栽培以来,很多地区相继发现洋桔梗易受多种病原真菌的侵袭。因此,本研究以’Double Mariachi Pink’洋桔梗为试材,通过农杆菌介导法,以叶片为外植体,将抗真菌的菜豆几丁质酶基因导入洋桔梗中,以期培育出抗真菌能力增强的洋桔梗新种质。具体研究如下:首先,通过对促进不定芽再生的最适细胞分裂素浓度以及抑制不定芽再生的最低卡那霉素浓度进行测定,确立最优转化体系。然后,将保存于-80℃冰箱中含有重组质粒pBI121-Chi(即携带菜豆几丁质酶基因的质粒)的LBA4404农杆菌进行活化,经过菌落PCR鉴定,将阳性结果的农杆菌制备成农杆菌侵染液,来侵染洋桔梗叶盘。接着,在Km选择压下,对通过直接筛选和延迟筛选两种方式得到的76个不定芽进行增殖筛选,共获得42个无根抗性苗系。然后将其转入生根筛选培养基中进行生根筛选,最终获得27个生根抗性苗系。随后,对这些生根的抗性植株进行PCR检测,经转接后2个月再进行一次PCR检测,获得11个阳性株系。选择长势良好、形成稳定株系的5个阳性株系,对其进行RT-PCR检测,鉴定出能够进行正常转录的3个株系。最后,通过3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定3个阳性转化株系的几丁质酶活性,并检测其对三种指示真菌(大豆链霉菌5A、5E以及灰葡萄孢菌)的抑菌作用,进而检测离体叶片对灰葡萄孢菌的抵御能力。几丁质酶活性测定结果表明,三个转基因株系(转6,转18,转26)的几丁质酶活性(0.215U、0.225U、0.286U)均比未转化株系(0.133U)高,且存在显著差异。在对三种指示真菌的抗性实验中,三个转化株系的抑菌效果(抑菌圈的大小)与未转化株系相比均存在显著差异,并且转26的抑菌圈直径均大于其他株系。在离体叶片对灰葡萄孢菌的抵御性检测中,未转化株系(对照)于第4d开始发病,转基因株系叶片6d后才开始发病,在第8d时,三个转基因株系的病斑面积(60.4、53.3、23.6mm2)与对照(128.2mm2)相比均存在显著差异。