论文部分内容阅读
根据GenBank上公布的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清1型和血清3型ApxⅣA基因全序列,设计了7对引物,对血清5型ApxⅣA基因全序列进行了分段PCR方法扩增和克隆。序列测定结果表明:APP血清5型ApxⅣA基因全序列全长5856bp,比GenBank上公布的血清1型和3型相应基因全序列分别长438bp和1287bp,与其同源率分别为95.5%和95.4%;与公布的血清5型的氨基酸序列的同源性为98.1%。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白具有亲水性,存在一个很明显的跨膜区,共有55个抗原决定簇,在整个序列的N段序列存在较强的抗原性。对APP血清5型ApxⅣA基因的氨基酸序列进行了二级结构、疏水性、抗原决定簇以及跨膜区的分析,选择抗原性较强的N端区域的部分基因进行原核表达。通过PCR扩增出了ApxⅣA,并将其克隆到PMD-18T载体上,经PCR、酶切和DNA测序鉴定之后,将ApxⅣA基因正确插入原核表达载体PET32a（+）的EcoRⅠ和XhoⅠ位点间,成功构建了重组表达质粒PET32atApxⅣA,重组表达质粒PET32atApxⅣA转化表达宿主菌BL21（DE3）,经IPTG诱导,表达出大小为62KD的APP重组蛋白。对重组蛋白进行了可溶性与不可溶性分析,结果表明表达产物主要以不溶性包涵体的形式存在。同时对诱导温度、诱导时间及IPTG浓度进行了优化,确定了最佳表达条件。以纯化的重组蛋白为包被抗原（重组蛋白量为0.28mg/ml）,建立了检测APP-5型感染的间接ELISA方法;结果表明当OD450≥0.31时即判定为阳性,当OD450＜0.31时即判定为阴性。且该方法能特异性地区别临床上的猪蓝耳病、猪链球菌、猪瘟、猪巴氏杆菌。表明该方法可以作为住传染性胸膜肺炎的临床诊断和检测。设计和合成一对检测APP的引物,建立了APP的核酸检测方法。特异性试验表明,该方法对APP的特异性好,不与猪巴氏杆菌,猪链球菌,猪大肠杆菌,猪沙门氏菌,绿脓杆菌反应;敏感性试验表明检测细菌的最低浓度为2500个/ml;以小鼠为实验动物建立APP感染模型,组织病料的检测结果表明病料直接检测或培养2h后各组织器官均不能扩增出APP特异条带,病料培养4h后,只有肝和肾组织能扩增出微弱的特异性条带,病料培养6h后从心、肝、脾、肺、肾中均可扩增出APP特异条带。