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目的:小补心汤(代号:XBXT)属于经典的中药复方,出自敦煌莫高窟遗书《辅行诀脏腑用药法要》,由四味中药(代赭石、旋复花、竹叶和淡豆豉)组成。本课题组前期通过抗抑郁综合评价体系发现小补心汤的总黄酮提取物(代号:XBXT-2)在多种抑郁动物模型上具有抗抑郁活性,为小补心汤抗抑郁的主要有效部位。下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis,HPA 轴)功能紊乱是抑郁症的发病机制之一,长期应激能够导致糖皮质激素(glucocorticoids,GC)水平不断升高,而高水平的GC会损伤和下调糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR),并且损伤海马神经元,此时HPA轴呈脱抑制状态,即出现HPA轴功能亢进现象,皮质酮、促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)等应激激素水平持续性升高,该病理生理现象是导致抑郁的机理之一。近年来也有研究发现,糖原合成酶激酶3β(GSK3β)及其相关信号通路与抑郁症的发生和药物抗抑郁作用的发挥密切相关。有研究表明,抑制GSK3β的功能(GSK3β磷酸化水平增加)能够产生抗抑郁作用。我们前期研究发现,XBXT-2有增强5-HT神经传导功能以及调节神经可塑性的作用,并可提高慢性应激模型大鼠海马脑区脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和 cAMP 反应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)磷酸化的表达水平。本课题拟在此基础上,围绕HPA轴和细胞内信号转导通路的功能调控进一步研究XBXT-2的抗抑郁作用及其机制,探讨XBXT-2对应激状态下HPA轴功能的调节作用及对海马的保护作用,以及对GSK3β及其相关信号通路的调控机制,以期能为中药抗抑郁机制的相关研究提供有益借鉴。方法:(1)采用小鼠慢性不可预知性温和应激模型(Chronic unpredictable mild stress,CUMS),每日给予1或2种应激因子,连续5w,随机给予BLBA/c小鼠以下刺激:禁食24h、禁水24h、倾笼45°12h、通宵照明12h、潮湿饲养12h、频闪(100次/分)1h、白噪声(110分贝)1h、夹尾1min,冷水游泳(水温10℃)5min。制备慢性应激模型小鼠,将小鼠随机均分为5组,正常对照(Control)组、慢性应激模型(CUMS)组、XBXT-2(25,50mg/kg)组和度洛西汀(Dlx 10mg/kg)对照组,应激的同时给予相应的药物处理,以开场活动、蔗糖偏嗜度以及新奇环境中的摄食潜伏期为观察指标,检测XBXT-2抗抑郁行为效应。(2)采用小鼠获得性无助模型(Learned helplessness,LH)进一步评价XBXT-2的抗抑郁活性。应用穿梭箱条件反射系统(电脑程序控制),给予ICR小鼠不可逃避的足底电击,连续5d,每日电击1h以诱导无助行为(helpless behavior),再经过穿梭箱回避程序筛选,然后将诱导无助行为成功的小鼠均分为模型组、XBXT-2(25,50mg/kg)组和Dlx(20mg/kg)对照组,连续4日灌胃给予相应药物,每日采用条件性回避反应测试程序测定小鼠的逃避失败次数和逃避潜伏期。(3)采用酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测慢性应激小鼠和获得性无助小鼠血清中皮质酮(Corticosterone,CORT)、促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropic hormone,ACTH)含量,采用免疫蛋白印迹法(Western blot)检测XBXT-2对获得性无助小鼠海马脑区GR蛋白表达的影响。(4)采用Western blot方法检测XBXT-2对慢性应激小鼠和获得性无助小鼠海马脑区Wnt2、BDNF、β-链蛋白(β-catenin)、蛋白激酶B(Akt)及其磷酸化、糖原合成酶激酶-3β(GSK3β)及其磷酸化表达的影响。(5)分别侧脑室微注射PI3k、Wnt2的阻断剂LY-294002、舒林酸(Sulindac),在信号通路上游阻断 PI3k/Akt/GSK3β、Wnt/β-Catenin 信号通路,通过小鼠悬尾、强迫游泳实验以及自发活动实验检测XBXT-2的抗抑郁行为学效应是否能被取消,进一步验证其抗抑郁的细胞内信号转导机制。结果:(1)XBXT-2(25,50mg/kg)长期给药可显著逆转慢性应激导致的小鼠蔗糖偏嗜度降低,并增加开场实验中小鼠的水平活动次数和垂直活动次数,表现为抗抑郁效应;(2)亚慢性给予XBXT-2(25,50mg/kg)可显著减少获得性无助小鼠逃避失败次数并缩短逃避失败潜伏期,表现为抗抑郁效应;(3)ELISA试验结果显示XBXT-2(25、50mg/kg)可显著性降低慢性应激小鼠和获得性无助小鼠血清CORT、ACTH水平,Western blot结果显示XBXT-2(25、50mg/kg)可增加海马GR蛋白的表达,表明XBXT-2对HPA功能亢进具有调控作用;(4)Western blot结果显示,XBXT-2(25、50mg/kg)能显著增加慢性应激小鼠海马脑区 Wnt2、BDNF、β-catenin、p-Akt、p-GSK3β 蛋白的表达,表明 XBXT-2 对GSK3β相关信号通路和神经营养具有调控作用;(5)侧脑室微注射PI3k的阻断剂LY-294002预处理后给予XBXT-2(100mg/kg)导致小鼠悬尾和强迫游泳的不动时间显著延长,提示阻断PI3k/Akt/GSK3β信号通路可减弱了 XBXT-2的抗抑郁活性;侧脑室微注射Wnt2的阻断剂Sulindac预处理后给予XBXT-2(100mg/kg)导致小鼠强迫游泳的不动时间显著延长,提示阻断Wnt/β-Catenin信号通路可减弱XBXT-2的抗抑郁活性。结论:XBXT-2在多种抑郁动物模型上具有明确的抗抑郁活性;其抗抑郁作用的发挥与抑制应激状态下HPA轴功能的亢进密切相关;其抗抑郁细胞信号转导机制可能与激活Wnt/β-Catenin和PI3k/Akt/GSK3β信号通路密切相关。