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桑黄,又名鲍氏层孔菌 Phellinus igniarius,(L.ex.Fr)Quel,是已知生物抗癌领域有效率最高的大型真菌,其显著的抗肿瘤功效日益引起人们的重视。在人们注重开发桑黄的情况下,市场上出现了不同名称的桑黄菌株,其中有不少为同物异名或同名异物,菌株名称的混乱影响其开发利用。本课题广泛收集国内外现有的10个桑黄桑黄菌株,通过形态培养观察、拮抗试验、酯酶同工酶分析和RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)分子标记方法对参试桑黄菌株的种性进行分析,并对优选出的桑黄菌株的多糖含量和活性进行研究,为桑黄资源开发提供科学依据。
实验通过聚丙烯酰胺酯酶同工酶凝胶电泳、拮抗实验和菌丝培养观察对10个桑黄菌株进行了分析。结果表明:酯酶同工酶电泳共检出56条谱带,其中迁移率(Rf)不同的谱带16条。S10与S9、S9与S8、S4与S10、S4和S5、S1与S7的酶谱差异明显(联合系数在0.207~0.365之间);S5与S9、S6与S7的酶谱相似(联合系数达到0.7左右)。酯酶同工酶分析结果与拮抗试验和菌丝培养观察结果一致。根据结果将其分为5类:S1、S4为一类,S3、S6、S7为一类,S2和S10为一类,S5和S9成一类,S8自成一类。
桑黄菌株的DNA提取试验结果显示应用CTAB(十二烷基硫酸钠)法提取的桑黄菌株的DNA电泳检测条带清晰,无拖尾,说明其纯度高,适合做为分子标记的模板。
正交实验确定了桑黄RAPD反应体系,当模板DNA1μL,Buffer(缓冲液)2.5μL,dnTP(单核苷酸)0.6μL,Taq酶(聚合酶)0.3μL,引物1μL,H2O19.6μL时RAPD产物电泳检测条带清晰,便于分析。从供试的100个随机引物中筛选出15个引物进行扩增,15个随机引物在7个供试菌株上都获得了较稳定的基因图谱,共扩增出167条清晰可用的DNA片段,其中101条为多态性条带,占60.5%。结果显示当聚类重新标定距离(Rescaled Distance Cluster Combine)为15时,可以将7个桑黄菌株分为4个种群,S1、S3、S6、S7为一类,S8、S9、S10各成一类。
应用经典的水提醇沉方法对桑黄不同菌株的菌丝体多糖进行提取并制作苯酚.硫酸法和DNS法标准曲线对其含量进行测定,结果显示S4和S7的多糖含量较高,达到0.7 g/g(多糖重/粗多糖重),而S3和S6的多糖含量仅为0.2 g/g左右。
通过薄层色谱法研究了菌丝体和子实体多糖的单糖组成,结果显示:①子实体多糖的单糖斑点颜色较菌丝体深,说明其含量相对较高;②子实体多糖的单糖组成为木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖;菌丝体多糖的单糖组成为木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖。
建立S180-抗癌动物实验模型,对菌丝体多糖和子实体多糖的抗癌活性进行研究,结果显示:①菌丝体多糖和子实体多糖都具有抗癌活性;②子实体多糖的抑瘤率(51.05%)要高于菌丝体多糖(32.10%),说明其抗癌活性高于菌丝体多糖。