【摘 要】
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通过小白鼠生物过滤方法从重庆地区仔猪水肿病流行病例中分离到一株溶血性大肠杆菌,经毒力试验、产毒特性以及毒力因子检测等方法证明分离菌为水肿病的病原菌;经培养特性、生
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通过小白鼠生物过滤方法从重庆地区仔猪水肿病流行病例中分离到一株溶血性大肠杆菌,经毒力试验、产毒特性以及毒力因子检测等方法证明分离菌为水肿病的病原菌;经培养特性、生化试验以及因子血清检测,鉴定为O138:K81,暂命名为CD18株.参照Imberechts等报道的EHEC F107菌毛主要亚单位fedA基因序列,以及Gunzer等报道的类志贺氏毒素Ⅱ型变异型(SLT-Ⅱe)的B亚单位序列分别设计了二对引物(P1、P2和P3、P4),以分离的流行强毒株CD18基因组DNA为模板,采用聚合酶链反应(PCR),分别扩增出约200bp和500bp的核酸片段,与预计值相符,证明CD18株含有水肿病菌株的两个最重要毒力因子基因.在此基础上利用DNA重组技术将扩增的fedA PCR产物纯化后克隆到PUC19质粒中,再亚克隆到表达载体pET28b(+)的SalⅠ-HindⅢ位点之间,经SalⅠ、HindⅢ、SmaⅠ进行单、双酶切鉴定后,将阳性重组质粒pET28b(fedA)进行测序分析.将重组质粒pET28b(fedA)转入BL21(DE3)中通过IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测比空载体多一条约20KD的蛋白;6×His affinity tag IMAC亲和层析显示该蛋白能被亲和纯化.经镍柱吸附,咪唑梯度洗脱,280nm紫外分光光度计检测,在50-100mM时有一沈脱峰,SDS-PAGE电泳约为20KDa的蛋白条带.由于表达的目的蛋白含有载体中6×His等32个氨基酸残基的多肽约4KDa,预计表达产物约为19.5KDa,试验结果与此相符,初步推断得到表达.通过Western blotting试验证明该表达产物能与6×His的单克隆抗体结合形成特异的目的条带,说明表达产物为含有组氨酸标签的融合目的蛋白;将纯化的表达产物免疫健康家兔获得免疫血清,与野生菌能发生明显的凝集反应,证明该表达蛋白具有良好的免疫原性,进一步证明所插入的外源目的基因得到正确表达.以上工作为下一步研制亚单位疫苗,建立水肿病快速诊断方法和进一步构建重组减毒沙门氏菌口服疫苗打下基础.
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