论文部分内容阅读
环糊精是由糖基转移酶催化淀粉合成的改性淀粉,其不含还原性末端基团,并且具有较大的空腔和内疏水、外亲水等性质,在食品、医药、化工等方面具有广泛的应用前景。但目前对于环糊精的工业化生产仅限于a-、p-、Y-环糊精和少数几种溶解度非常小的大环糊精(DP9、DP10、DP14、DP26),因其它大环糊精在结构和性质方面相似,并且具有较高的水溶性,很难通过结晶的方法分离得到单体,在工业化生产上受到很大的限制。本文通过麦芽糖转糖基酶催化玉米直链淀粉生产大环糊精,分析研究乙醇、DMSO、CaCl2对其转化率和环化比例的影响,试图通过聚丙烯酰胺凝胶柱层析和硅胶柱层析分离聚合度16-20的单体大环糊精。研究结果如下：1.取-80℃保存的E.coli DH5a-MalQ菌种活化后提取重组载体,将重组载体用EcoRI和Not I进行双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳,得到分子量大小分别为2.1 kbp和3.6 kbp左右的两条单一条带,这与MalQ基因和pET-DsbA载体大小相符,表明已准确获得表达麦芽糖转糖基酶的重组载体pET-DsbA-MalQ,将重组载体pET-DsbA-Ma/Q导入到E.coli BL21感受态细胞中,得到既能高效表达麦芽糖转糖基酶,又能稳定保存的E.coli BL21-MalQ菌株。通过薄层色谱法分析酶活表明该酶具有转糖基酶活性,测得酶活为1.7U。2.利用麦芽糖转糖基酶催化玉米直链淀粉制备大环糊精,加酶量为20 U/g淀粉,50℃反应5 h。在反应液中添加乙醇、DMSO、CaCl2分析研究其对大环糊精制备过程中转化率和环化比例的影响,结果表明乙醇、DMSO对其转化率影响较小,而CaCl2随其浓度的增大转化率随之增大,且三种小分子物质对大环糊精环化比例的影响较显著,这一方面是由于有机分子和环糊精形成包合物,改变了环糊精的构象,另一方面刺激酶的构象的改变和酶的活性催化机制。利用Box-benhnken分析复配乙醇、DMSO和CaCl2对转化率和环化比例的影响,得到当终浓度分别为19%、9.7%、44.5 mmol/L时,转化率和环化比例分别达到29.4%和94.07%,比优化前转化率提高30%,环化比例提高20%左右。3.在大环糊精制备过程中加入终浓度为19%乙醇、9.7% DMSO、44.5 mmol/L CaCl2时,不仅转化率和环化比例分别提高了30%和20%,而且16-20单一聚合度大环糊精含量的比例显著提高,分别升高3.66、9.2、6.62、5和6.33倍。利用两根规格分别为100 cm×1.2 cm i.d和70 cm×1.2 cm i.d的Bio-GeL P-4凝胶柱用长度为4cm的细管连接,得到总有效柱高为160×1.2 cm的聚丙烯酰胺凝胶柱分离大环糊精粗品,再用硅胶柱(20×1.2 cm i.d)层析法,有效柱高为18cm×1.2cm,分离得到聚合度16-19的大环糊精。