论文部分内容阅读
目的：观察青藤碱联合甲氨蝶呤治疗胶原诱导性关节炎大鼠类风湿性关节炎的疗效并探究其联合用药的作用机制。方法：1.体内实验使用天然Ⅱ型牛胶原诱导SD大鼠关节炎模型,随机分为：模型组(MODEL, n=8);青藤碱中剂量组(medium does SIN, m-SIN, n=8),120mg/kg.d,灌胃给药；青藤碱低剂量组(low dose SIN,1-SIN, n=8),60mg/kg.d,灌胃给药；甲氨蝶呤组(MTX, n=8), lmg/kg.w,腹腔注射；青藤碱低剂量联合甲氨蝶呤组(1-SIN+MTX, n=8),青藤碱120mg/kg.d灌胃合并甲氨蝶呤lmg/kg.w腹腔给药；青藤碱中剂量联合甲氨蝶呤组(m-SIN+MTX, n=8),青藤碱120mg/kg.d灌胃合并甲氨蝶呤lmg/kg.w腹腔注射；另设12只作为对照组(CONTROL, n=12),灌胃等体积生理盐水。二次免疫注射后每三天进行一次体重称量及大鼠关节炎指数评分,同时观察大鼠状态；第52天大鼠眼眶内呲取血,血常规检测各组大鼠白细胞计数、血小板计数,血红蛋白计数；生化指标检测大鼠血清谷丙转氨酶水平以及碱性磷酸酶活力。使用ELISA法分析大鼠血清中白介素17、白介素lα、白介素6、基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13以及破骨细胞抑制因子、NF-κB配位体受体活化剂的分泌水平。大鼠关节HE染色,对比各组大鼠踝关节炎症细胞浸润、滑膜细胞增殖、软骨侵蚀以及骨破坏程度。2.体外实验使用类风湿性关节炎患者滑膜细胞进行原代细胞培养。MMT法检测不同给药组对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞增殖的影响；使用金氏公式评价不同给药组的协同与拮抗作用。提取滑膜成纤维细胞总RNA, RT-RCR将滑膜成纤维细胞总RNA逆转录为cDNA;使用EAL TIME-PCR法检测给药组滑膜成纤维细胞破骨细胞抑制因子、NF-κB配位体受体活化剂基因相对量。结果：1.体内实验造模成功大鼠48只,随机分为MODEL组、MTX组、]m-SIN组、m-SIN+MTX组、1-SIN组和1-SIN+MTX组,每组8只。MTX组、m-SIN组、m-SIN+MTX组以及1-SIN+MTX组大鼠关节肿胀得到明显遏制(P<0.05),且体重均得到良好控制；1-SIN组大鼠关节肿胀较其他组严重,体重也低于其他给药组。MODEL组大鼠白细胞计数、血小板计数、血红蛋白均高于CONTROL组(P<0.05)。MTX组、m-SIN组白细胞水平下降,血红蛋白水平升高(P<0.05)；1-SIN组三者水平与MODEL组无差异；1-SIN+MTX组仅白细胞、血小板水平降低(P<0.05), m-SIN+MTX组能够显著降低三者水平(P<0.05)。5组给药组大鼠碱性磷酸酶水平均降低(P<0.05),其中m-SIN+MTX组碱性磷酸酶水平显著低于其他组(P<0.05)。MTX组、m-SIN+MTX组以及1-SIN+MTX组能显著降低大鼠血清白介素6水平(P<0.05),且两药联合组白介素6水平显著低于两者单用组(P<0.05)。m-SIN+MTX组白介素1α水平降低(P<0.05),其它给药组白介素1α水平与MODEL组无差异。1-SIN、m-SIN以及MTX单用组均未能显著降低白介素17水平；m-SIN+MT组、1-SIN+MTX组白介素17水平显著下降(P<0.05),两组具显著性差异。1-SIN组大鼠基质金属蛋白酶1、金属蛋白酶3、金属蛋白酶13水平与MODEL组无差异,m-SIN组大鼠仅金属蛋白酶3水平降低(P<0.05); m-SIN+MTX组、1-SIN+MTX组和MTX组三者水平显著降低(P<0.05)。MODEL组大鼠NF-κB配位体受体活化剂水平显著高于对照组,破骨细胞抑制因子、O/R值显著低于CONTROL组(P<0.05)。MTX组NF-κB配位体受体活化剂水平低于MODEL组(P<0.05),但破骨细胞抑制因子、破骨细胞抑制因子/NF-κB配位体受体活化剂比值与模型组无差别(P>0.05);1-SIN组三者水平与MODEL组无差异。1n-SIN+MTX组、1-SIN+MTX组、m-SIN组与MODEL组相比,NF-κB配位体受体活化剂水平下调,破骨细胞抑制因子水平上调,破骨细胞抑制因子/NF-κB配位体受体活化剂比值相应增大(P<0.05),其中m-SIN+MTX组与单用组相比具显著性差异(P<0.05)。大鼠关节HE染色显示：MTX组能控制炎症发生,抑制血管翳形成,但未能有效保护软骨和软骨下骨质；1-SIN不能有效抑制炎症以及破骨细胞生成；m-SIN组能控制炎症,一定程度保护软骨不受侵蚀,抑制破骨细胞生成；1-SIN+MTX组、m-SIN+MTX组不仅能控制炎症,也能保护骨质,显著减少破骨细胞生成。2.体外实验使用型胶原酶提取类风湿性关节炎病人滑膜成纤维细胞。MTT法检测给Ⅱ药组对细胞增殖的影响,其中sinlmtx4组(5mg/mlsin+0.001mg/mlmtx)、 sin2mtx2组(2mg/mlsin+0.1mg/mlmtx)、sin3mtx4组(1mg/mlsin+0.001mg/mlmtx)与control组相比能够显著抑制滑膜细胞增殖(P<0.05)。金氏公式评价联合组协同作用,其中sin2mtx2组(2mg/mlsin+0.1mg/mlmtx)Q值达到6.42,明显高于其他组,表明中浓度SIN与低浓度MTX的联合能够发挥显著协同作用。REAL-TIME PCR检测12h、24h给药组对滑膜成纤维细胞NF-κB配位体受体活化剂、破骨细胞抑制因子表达的影响：sin2mtx2(2mg/mlsin+0.01mg/mlmtx)与其它组相比能够显著降低NF-κB配位体受体活化剂的表达,上调破骨细胞抑制因子表达,且12小时与24小时表达量无显著性差异。结论：1、体内实验表明,SIN与小剂量MTX联合用药组疗效强于单用组,而m-SIN+MTX组与1-SIN+MTX组相比,更能显著降低CIA大鼠的关节肿胀、降低RA疾病活动期的白细胞、血小板计数、血红蛋白含量以及碱性磷酸酶活性；通过降低白介素1α、6、17水平发挥抗炎作用；直接并间接降低基质金属蛋白酶-1、3、13水平,保护软骨不受破坏；同时下调NF-κB配位体受体活化剂表达、上调破骨细胞抑制因子表达,升高破骨细胞抑制因子/NF-κB配位体受体活化剂比值,抑制破骨细胞前体向破骨细胞转化,抑制骨破坏发生。在检测大鼠谷丙转氨酶水平时发现,SIN与MTX联用一段时间后其水平升高,因此应密切监测肝功能,酌情减量并加用保肝药,以防不良反应发生。2、体外实验表明,中浓度SIN与低浓度MTX的联合能够充分发挥协同作用,显著抑制RA滑膜细胞的增殖,下调NF-κB配位体受体活化剂表达、上调破骨细胞抑制因子表达,升高破骨细胞抑制因子/NF-κB配位体受体活化剂比值,阻止破骨细胞生成,抑制骨破坏。