目的：　　诺卡菌是一种重要的机会性致病菌，人类通过呼吸道或经伤口感染后，能引发多种临床症状，严重时可造成死亡。随着诺卡菌感染率的逐年增加，逐渐引起人们对该病原菌的重视。本研究利用16S rRNA基因分析诺卡菌种间的序列，以研究16SrRNA基因分型方法在临床应用中诺卡菌菌种鉴定的应用价值，为临床应用中快速、准确鉴定诺卡菌奠定基础。选取20株诺卡菌进行二代高通量测序，应用最小核心基因组分型方法对诺卡菌进行分型和鉴定，同时对基因组的毒力基因进行分析，为诺卡菌的分子分型提供新的思路，也为进一步研究诺卡菌的致病机制提供参考依据。　　方法：　　1.对49株诺卡菌16SrRNA基因进行扩增，将获得的序列与从GenBank数据库下载的32株诺卡菌的16S rRNA基因序列进行分析，应用DNASTAR程序对这81株诺卡菌16S rRNA基因的序列分析处理，计算种内及种间相似性，用MEGA6.06构建系统进化树。　　2.选取20株诺卡菌，提取核酸构建二代高通量测序文库，利用Illumina Hiseq2500高通量测序平台完成文库样品测序，采用SOAP denovo软件对测序之后得到的数据进行组装，应用OrthoMCL程序，对从本研究测序的20株诺卡菌基因组数据和从GenBank数据库中下载的37株诺卡菌基因组数据进行最小核心基因组的分析。应用Muscle和MEGA6.06软件，构建基于最小核心基因组(minimalcore genome，MCG)的聚类树。对毒力基因的分析，则通过Pubmed文献检索功能查询诺卡菌的毒力相关基因，分析毒力相关基因在不同诺卡菌的分布情况及毒力基因的同源性研究，并利用Cluster/TreeView软件画出毒力相关基因分布热力图。　　结果:　　1.诺卡菌16S rRNA基因序列种内相似性为99.1％～100％，种内相似度最高的有鼻疽诺卡菌、短链诺卡菌和克鲁吉亚诺卡菌，均可达100％;种内相似性最低有星形诺卡菌和南非诺卡菌，分别为99.2％和99.1％。诺卡菌属16S rRNA基因种内及亚种间相似性均在99.0％以上;诺卡菌种间16SrRNA基因序列相似性为95.5％～98.8％，其中脓肿诺卡菌和星形诺卡菌相似度最大，达98.1％～98.8％;南非诺卡菌和肉色诺卡菌相似性最低，为95.5％～96.0％。　　2.以脓肿诺卡菌(DSM44432)作为变异点参考序列，分析诺卡菌16SrRNA基因序列中碱基变异位点及其易变区，诺卡菌16SrRNA基因序列（选取1392bp的测序可信长度）存在的碱基变异位点有116个，易变区大致可分为4个，分别在119bp～137bp、515 bp～542bp、919bp～941bp、1031bp～1068bp位点之间。　　3.基于纳入分析的诺卡菌16S rRNA基因序列构建系统发育进化树，在进化树中13种诺卡菌大致被聚集为11个群，还有3种诺卡菌无法有效分离，属于新星诺卡菌复合物即老兵诺卡菌、非洲诺卡菌和克鲁吉亚诺卡菌。另外，本研究中所选取的临床分离株（已被鉴定为鼻疽诺卡菌），在进化树中与鼻疽诺卡菌标准株聚集成一簇，其亲缘关系也十分相近。　　4.选取20株诺卡菌进行全基因组测序分析，共获得双末端测序数据40Gb左右，12，608，226个读段(read)，每株菌平均测序深度为418×（基因组上每一个单碱基平均被测序或者读取了418次），最大测序深度可达到629×。每株菌的reads经过拼接组装，基因组大小差异较大，最小为6.08Mbp，最大可达9.45Mbp;平均可预测得到6963个基因/菌株;平均(G+C)含量为68％。　　5.对57株诺卡菌的基因组数据使用MCG分型方法分析，获取225个基因构成最小核心基因组，在整个基因组中占比不到4％;最小核心基因组基因功能主要以基础代谢调控、物质转运为主。其中，以翻译、核糖体结构及生物合成功能占比例最大，其次为翻译，氨基酸转运和代谢，辅酶的转运和代谢功能，所占比例最小的是防御功能相关基因。　　6.基于核心基因组的串联序列，构建诺卡菌核心基因组聚类树，各个种的诺卡菌多数能分在不同的分支上，同种的诺卡菌绝大部分可聚成一簇;而ICDC83老兵诺卡菌与新星诺卡菌、少食和短链诺卡菌分别聚在同一分支，且亲缘关系很近;聚集成一簇的鼻疽诺卡菌间遗传距离不一。　　7.210个毒力基因在30种诺卡菌中的携带数量为15(7.1％)～170(80.9％)，其中盖尔森基兴诺卡菌GUH-2内毒力基因数量最多，为170(80.9％);其次为巴西诺卡菌(153，72.8％)、鼻疽诺卡菌(144，68.6％)、Nocardia tenerifensis(131，62.4％)，均分离自人;诺卡菌属348MFTsu5所含毒力基因数量，最少为15(7.1％)，分离自自然界。　　8.诺卡菌的毒力基因主要编码过氧化氢酶，超氧化物歧化酶，细胞壁脂质，蛋白酶，mce蛋白等。210个毒力基因中，mce基因所携带的数目最多，为48个，占22.9％;其次为蛋白酶(potease)基因，携带有46个，占21.9％，编码脂蛋白(Lipoprotein)，亚硝酸还原酶(Nitrite reductase)基因也有一定数目，分别为19个(7.6％)和11个(5.2％)。　　9.13个毒力相关基因(nfa13050，nfa37890，NOCYR_0626，NOCYR_0144，NOCYR_5051, NOCYR_0327, NOCYR_0407, NOCYR_1396, NOCYR_1397,NOCYR_2248，NOCYR_5510，NOCYR_0085，NOCYR_0548)在57株诺卡菌基因组中均存在，编码蛋白酶，超氧化物歧化酶，ABC转运蛋白，烷基氢过氧化物还原酶，龙胆酸，异柠檬酸裂解酶等，与基础代谢调控与物质转运有关。　　结论：　　1.16S rRNA基因序列分析是一种简单，快速，特异性好的诺卡菌菌种鉴定方法，除了诺卡菌复合体内亚种无法分离外，能将基他诺卡菌株鉴定至种的水平。可在临床上广泛应用。　　2.基于最小核心基因组构建聚类树中大致能将诺卡菌不同种聚集成不同的群，诺卡菌复合体亚种也无法分离开;但是在鼻疽诺卡菌在MCG聚类树中可出现较显著的遗传差异，说明MCG分型方法能在诺卡菌种内进行分型，为种内进化关系提供新的认识。　　3.通过生物信息学技术对诺卡菌基因组进行分析，能大致了解诺卡菌基因组的基本特征如基因组大小，GC含量，编码的基因数等;而对不同诺卡菌种间毒力基因进行分析，能预测诺卡菌侵袭宿主过程中以及在宿主中低氧环境中存活相关基因，对致病机制的研究具有重要的参考价值。