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目的:观察慢性应激肝郁脾虚模型大鼠下丘脑外侧区(Lateral hypothalamic area,LHA)食欲素A(Orexin A,OXA)和食欲素受体1(Orexin receptor 1,OX1R)变化及逍遥散的干预效应,探讨慢性应激致机体出现食欲下降的中枢神经内分泌机制及逍遥散的作用机理。方法:72只健康雄性SD大鼠(体重180±20 g)随机分为3组,即空白对照组(the control group)、模型组(the model group)和逍遥散组(the Xiaoyaosan group),每组24只。标准动物房饲养,室温(21±1)℃,相对湿度40%-60%,光照明暗各12 h(明7:00-19:00,暗19:00-7:00)。各组大鼠均适应性饲养1周,自由进食水。模型组和逍遥散组大鼠以捆绑束缚方式(每天3 h连续21天)建立慢性应激肝郁脾虚动物模型。于每天束缚前30 min逍遥散组大鼠灌服逍遥散混悬液(3.85 g-1·kg-1·d-1),模型组大鼠灌服等体积生理盐水。空白对照组常规饲养,灌服等体积生理盐水。根据大鼠体重调整用药量。各组大鼠均于每日灌胃前称取体重及摄食、饮水量,同时观察大鼠皮毛、粪粒性状、束缚反应等外观表现;于实验第0、7、21天进行旷场实验(open field text,OFT)和高架十字迷宫实验(the elevated plus maze,EPM)观测各组大鼠行为学变化。实验结束,以2%戊巴比妥钠(4 mg/100g体重)腹腔注射麻醉取材:每组随机取6只大鼠行左心室升主动脉灌注固定,断头取脑,以免疫荧光双染法检测LHA中OXA、OX1R与瘦素受体(Leptin receptor,ob-R)蛋白表达情况;其余大鼠断头取血,并剥离全脑,以间苯三酚法测定血清D-木糖含量,以酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定血清Leptin含量和脑组织LHA中OXA含量,实时荧光定量PCR(quantitative real-time reverse transcription PCR,q RT-PCR)方法检测LHA中OXA、OX1R、ob-R m RNA表达情况。结果:1各组大鼠一般状态情况实验期间,大鼠无死亡。空白对照组大鼠一般状态无明显变化,耳廓和鼻头红润,眼角清洁,眼球运动灵活,皮毛色白光泽,大便成颗粒状且干湿适中。束缚造模后,模型组大鼠在第1周表现出易激惹状态,提尾根部易反颈抓咬,在笼内表现出弓背、毛发竖立的攻击样姿态,束缚时易从束缚架上挣脱,或啃咬束缚带或束缚架;束缚第2周模型大鼠警惕性强,但束缚时反抗、撕咬和挣脱等表现稍减;第3周,捕捉时模型大鼠反抗减弱,蜷卧懒动,喜扎堆趴窝,毛发杂乱枯黄无光泽,大便时干时稀,眼角有分泌物,耳廓和鼻头颜色变淡,束缚时几无反抗,束缚过程中多嗜睡,但易惊醒,解除束缚放回笼中后多聚集蜷缩。逍遥散组大鼠在束缚之初与模型组大鼠表现基本无差异,束缚1周后激惹状态较模型组有所缓解;束缚2周后,逍遥散大鼠动作较模型大鼠灵活,大便成形且干湿适中,耳廓和鼻头稍有色淡但亦显红润,眼角较为清洁,偶有分泌物,皮毛稍有黯淡,但仍不失光泽整齐清洁。2各组大鼠体重、摄食量和摄水量变化情况与空白对照组大鼠比较,模型组大鼠体重增长减缓,摄食量和摄水量总体呈减少趋势(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,逍遥散组大鼠体重、摄食量和摄水量均有所改善(P<0.05或P<0.01)。3各组大鼠行为学检测结果与空白对照组比较,实验第7天和第21天,模型组大鼠在旷场试验中5 min移动总距离,中央区移动距离、停留时间及总穿格数均明显减少(P<0.01);高架十字迷宫实验模型组大鼠5 min开放臂停留时间及进入次数,中央平台停留时间及进入次数,以及进入封闭臂次数亦明显减少(P<0.05或P<0.01),但在封闭臂内的停留时间增加(P<0.01)。与模型组比较,逍遥散组上述指标总体改善(P<0.01)。4间苯三酚法检测血清D-木糖含量结果与空白对照组比较,模型组大鼠血清D-木糖含量下降(P<0.01);与模型组比较,逍遥散组大鼠血清D-木糖含量显著升高(P<0.01)。5 ELISA方法检测各组大鼠血清Leptin和LHA中OXA含量结果与空白对照组比较,模型组大鼠血清Leptin含量显著升高(P<0.01),LHA中OXA含量减少(P<0.01);与单纯应激模型大鼠比较,逍遥散组大鼠血清Leptin含量明显下调(P<0.05),LHA中OXA含量上调(P<0.01)。6免疫荧光双染法检测LHA中OXA、OX1R与ob-R蛋白表达结果OXA与OX1R被标记为红色荧光,ob-R标记为绿色荧光。统计结果显示,与空白对照组比较,模型组大鼠LHA中OXA与OX1R的阳性细胞表达数、阳性表达面积和积分光密度(integrated optical density,IOD)均明显下降(P<0.01),但ob-R表达增加(P<0.01)。与模型组比较,逍遥散组上述指标明显改善(P<0.05或P<0.01)。共表达结果显示,模型组OXA与ob-R的相关系数(Pearson’s correlation)较空白对照组升高(P<0.01);与模型组比较,逍遥散组OXA与ob-R的相关系数升高(P<0.05)。与空白对照组比较,模型组OX1R与ob-R的相关系数较空白对照组下降(P<0.01);模型组和逍遥散组之间比较无统计学差异(P>0.05)。7 q RT-PCR方法检测LHA中OXA m RNA、OX1R m RNA与ob-R m RNA表达结果与空白对照组比较,模型组OXA m RNA与OX1R m RNA表达水平明显下降(P<0.01),ob-R m RNA表达水平则明显上升(P<0.01);与模型组比较,逍遥散组大鼠OXA m RNA与OX1R m RNA表达水平明显上调(P<0.01),ob-R m RNA则下调(P<0.01)。结论:1慢性应激致肝郁脾虚样模型大鼠出现食少便溏、体重增长减缓等脾胃失于健运的原因与LHA中OXA与OX1R表达下降,ob-R表达增高有关。其机制可能是外周过多的Leptin通过血脑屏障进入LHA结合ob-R抑制了OXA与OX1R合成与分泌。2逍遥散可通过调节LHA中OXA、OX1R与ob-R的表达以及下调血清Leptin含量,以发挥疏肝健脾,调节脾胃功能的作用,其调节作用可能通过调控Leptin-ob-R-OXA/OX1R摄食通路实现。