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细菌作为单细胞原核生物,在自然界有两种存在方式,一种以游离单细胞方式生存,另一种以多细胞聚集方式生物膜(biofilm)形式生存。生物膜的形成有助于微生物适应环境,增强对环境中各种胁迫因素的抵抗力。有关生物膜的组成成分、代谢调控网络和信号通路,在模式细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中已经得到深入研究。蜡样芽抱杆菌(Bacillus cereus)作为一种在自然界广泛分布的产芽孢革兰氏阳性细菌,其生物膜组成和形成的调控机制尚不明确,还有待深入研究。蜡样芽孢杆菌0-9菌株是从小麦根系分离获得一株生防细菌,能够有效防治小麦纹枯病等多种土壤传播病害。研究该生防菌的生物形成机制,有助于理解该菌株在小麦根系的定殖和生防机制。本研究中,通过筛选前期构建的Bacillus cereus 0-9菌株转座子Tn YLB-1插入突变体库,从600个转座子插入突变菌株中获得2个生物膜产量变化的突变体。其中突变体编号为239生物膜形成量较野生型增加,突变体编号为551生物膜形成量低于野生型,分离转座子插入位点侧翼序列和同源性比对发现突变体239与枯草芽孢杆菌的调控生物膜形成转录基因因子RemA的表达基因具有同源性,因此将该基因命名为remA;突变体55 1基因产物注释为生物膜形成调节因子,因此,我们命名该基因为mrbF。在此匕基础上,采用同源重组方法分别敲除remA和mrbF,构建基因敲除突变体ΔremA和ΔmrbF,测定上述敲除菌株的生物膜形成,显示出与转座子插入突变体相同的表型改变,基因互补后,能够恢复生物膜形成表型至野生型0-9水平,证明筛选出的转座子插入突变体出现的生物膜形成变化就是由于remA和mrbF基因失活的结果。为了揭示remA在蜡样芽孢杆菌生物膜形成中的作用,转录组测序比较了缺失菌株ΔremmA和野生型B.cereus 0-9在稳定生长期的基因表达差异,结果显示,remA缺失后,突变体有857个基因表达上调,有543个基因表达下调。其中生物膜形成转录调节阻遏因子SinR和AbrB调控的sip W-tasA操纵子及基因calY表达下降,暗示 remA调节生物膜形成不是通过SinR和AbrB介导的生物膜形成信号通路发挥作用。为了证明这种推测,在△emA菌株中分别敲除sinR和abrB基因,构建双基因缺失菌株ΔremAΔsinR和ΔremAΔabrB,测定表型发现2个双基因缺失菌株生物膜形成表型均呈现出中间表型。同时,采用qRT-PCR和转录融合测定ΔremA和B.cereue 0-9中sip W-tasA和calY基因表达动态,显示出与转录组测序中一样的表达动态,即remA缺失后,sipW-tasA和calY基因表达下降。上述证据表明remA缺失导致生物膜形成增加不是通过SinR和AbrB介导的生物膜形成信号通路发挥作用。胞外DNA是生物膜的组成成分之一,操纵子lrgAB在多种细菌中调控细菌的裂解和程序性死亡。基于转录组数据,发现remA缺失后,蜡样芽孢杆菌lrgAB操纵子表达显著下降。为了分析RemA是否通过调控lrgAB操纵子影响生物膜形成,分别构建了lrgAB敲除菌株和超表达菌株,发现敲除菌株的生物膜形成增加,超表达后,生物膜显著下降。进一步测定remA缺失菌株、lrgAB缺失菌株和超表达菌株形成生物膜中的死活细胞比例及胞外DNA的含量,发现remA和lrgAB缺失后,生物膜中细胞死亡增加,胞外DNA含量增加,而lrgAB超表达菌株显示出相反的结果,表明RemA通过正调控lrgAB从而控制细胞死亡和胞外DNA释放,从而影响生物膜形成。基于上述结果,提出了 RemA调控生物形成的作用模型:RemA正调控lrgAB的表达,lrgAB编码产物控制细胞的死亡和胞外DNA释放。当remA缺失后,lrgAB表达降低,通过某种未知机制,促进细胞裂解和胞外DNA释放,从而提高生物膜的产量。为了揭示基因mrbF在生物膜形成中的作用,在mrbF基因缺失菌株的基础上分别敲除abrB和sinR构建双基因缺失菌株ΔmrbFΔsinR和ΔmrbFΔabrB,生物膜形成表型测定显示ΔmrbFΔsinR的生物膜形成类似于ΔmrbF表型,ΔmrbFΔabrB生物膜形成类似于ΔmrbF生物膜表型,而SinR和AbrB都是通过负调控sip W-tasA和calY基因表达来调控生物膜形成的。因此,推测mrbF是通过SinR和AbrB调控的生物膜形成信号通路来发挥作用。为了证明这种推测的正确性,构建calY启动子和绿色荧光蛋白GFP融合的载体并分别插入到B.cereue 0-9和△mrbF基因组中,转录融合测定了 calY基因表达动态,发现在生物膜形成条件下,calY在ΔmrbF菌株中的表达时间和最大表达量均低于其在B.cereue 0-9中的表达,证明mrbF通过作用于SinR和AbrB调控的信号通路来影响生物膜形成的。芽孢形成主效调节因子Spo0A在芽孢发育和生物膜形成中起中心作用,它通过调控sinR和abrB基因表达影响生物膜形成。为了分析mrbF影响生物膜是否通过Spo0A起作用,转录融合测定了 abrB启动子的表达动态,结果表明,在生长前期abrB启动子在△mrbF菌株中的活性高于其在B.cereue 0-9中的活性。在后期低于其在B.cereue 0-9中的活性。测定了受Spo0A磷酸化形式(Spo0A～P)调控的芽孢发育第Ⅱ阶段调控蛋白SpoⅡG编码基因的表达,显示spoⅡG在mrbF中的表达水平也显著低于其在B.cereue 0-9中的表达,结合ΔmrbF突变体产孢延迟的表型,表明mrbF影响生物膜形成和芽孢产生是通过调控spo0A基因表达或抑制其产物Spo0A的磷酸化来实现的。基于上述结果,提出了mrbF调控生物膜形成的作用模型:mrbF产物促进spo0A的表达或其产物的磷酸化,进而分别抑制和促进abrB与sinR的表达,二者通过调控sip W-tasA和calY的转录来调控生物膜形成。