杆菌肽是一种由12个氨基酸残基组成的多肽类抗菌肽,主要由枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌通过非核糖体多肽合成酶合成。杆菌肽可以抑制革兰氏阳性细菌和部分革兰氏阴性菌细胞壁的合成,常被用于饲料添加剂。前体物的供应可能是限制杆菌肽高产的重要因素,前期研究发现提高异亮氨酸和缬氨酸的供给可以提高杆菌肽的产量,其中异亮氨酸的效果比较显著。本研究利用基因工程的方法,强化了支链氨基酸的合成途径、削弱了支链氨基酸的旁路途径和改造了支链氨基酸的转运途径,进而提高胞内支链氨基酸的含量,发现过表达支链氨基酸氨基酸合成途径关键酶乙酰羟酸合酶基因ilvB和缺失支链氨基酸转运蛋白YhdG可以提高杆菌肽的产量。最后,我们通过在ilvB过表达工程菌中缺失转运蛋白YhdG,进而成功获得杆菌肽高产菌株。本研究通过KEGG和NCBI数据库,发现在大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌中异亮氨酸的合成过程中有4个关键酶,分别是天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸脱氨酶和乙酰羟酸合酶,其中乙酰羟酸合酶是支链氨基酸合成的共有关键酶;支链氨基酸旁路途径甲硫氨酸合成的关键基因为metA,编码高丝氨酸琥珀酰基转移酶的合成;枯草芽胞杆菌中支链氨基酸转运蛋白主要有BmFE、BrnQ和YhdG(BcaP)等,其中YhdG是最有效的支链氨基酸转运蛋白。我们通过基因工程的方法,对支链氨基酸合成途径的五个基因进行了强化表达,同时构建甲硫氨酸关键基因metA和转运蛋白基因yhdG的缺失工程菌。其中,支链氨基酸合成基因中乙酰羟酸合酶基因ilvB游离型过表达工程菌相的杆菌肽产量比原始菌DW2提高了 11.01%,为了消除游离质粒的影响,将ilvB整合到DW2基因组中整合型过表达,其杆菌肽产量相比DW2提高了 14.06%;而转运蛋白YhdG缺失工程菌的杆菌肽效价达到917.35 U/mL,比DW2提高了 11.21%。最终,我们在ilvB整合型过表达工程菌中缺失了转运蛋白基因yhdG的工程菌,其杆菌肽效价达到995.25 U/mL,比原始菌DW2提高了 21.11%。为了研究乙酰羟酸合酶基因ilvB过表达对菌株代谢的影响,我们检测了杆菌肽发酵过程中胞内外支链氨基酸、赖氨酸和甲硫氨酸的氨基酸变化,发现支链氨基酸的含量在杆菌肽合成期显著提高,而赖氨酸和甲硫氨酸基本与原始菌一样。同时,我们也研究了转运蛋白YhdG对杆菌肽产量的影响,我们通过过表达和缺失基因yhdG,并检测了检测他们的相对转录量,发现yhdG的转录量越高,杆菌肽产量越低。然后我们进一步检测了yhd 缺失工程菌中支链氨基酸的变化情况,发现地衣芽胞杆菌DW2中YhdG的功能为外排支链氨基酸,这与枯草芽胞杆菌中报道的功能相反。此外,我们通过检测其他常见的17种氨基酸,证明YhdG并不是支链氨基酸的特异性转运蛋白。本研究成功构建了杆菌肽高产菌株DW2::ilvB△yhdG,并通过将培养基氮源豆粕浓度从10%优化到8%,将杆菌肽效价提高到1060.03U/mL,同时也降低了原料成本,为杆菌肽的工业化生产奠定了基础。