基于PCR的体外诱变法发展至今，使用的引物从重组PCR法(Recombination PCR)的至少4条引物到大引物PCR法(Megaprimer PCR)的3条引物，再到Quikchange快速突变法(QuikChange Mutagenesis PCR)的2条引物。从至少3轮PCR反应发展到只需2轮，到Quikchange法及反向PCR法(Inverse PCR)的仅使用一轮PCR反应，步骤越来越简单，操作越来越简便，为使用PCR技术进行各种基因克隆操作的科学工作者节省了大量的时间和精力。 近几年，有文献报道使用基于Quikchange原理的方法来制作DNA片段的插入、替代以及删除突变，但由于QCM-PCR的低产量，难以产生阳性克隆。而采用末端相对的(tail-to-tail)引物设计方法的反向PCR则需要用连接酶连接PCR扩增产物，操作麻烦且阳性率也偏低。 我们实验室一直在寻找一种简单高效的可以用于基因的删除、插入及替代突变的方法，通过大量研究和实验发现，可以使用一种基于反向PCR原理，使用全新的引物设计的突变方法--“COP”突变法，该方法采用与QuikChange点突变法相同的操作步骤，其策略是设计一对中心重合(Central overlap)的引物，长引物的5’端序列和3’端序列的Tm值均不低于66℃，短引物Tm值约为长引物一半，且与长引物中心重合互补。这种方法能用于超过20bp的碱基的插入或替代突变，及用于超过2000bp DNA片段的删除突变的研究。 这种方法引物设计极为简单，能快速构建突变质粒，可以用于多点突变，删除，替代，插入等多种基因克隆操作，有85％以上的阳性产率。