论文部分内容阅读
单宁酰基水解酶(Tannase EC3.1.1.20),又称单宁酶,是一种由微生物在单宁存在条件下诱导而产生的细胞膜结合酶,能催化单宁及没食子酸酯类中的酯键和缩酚键的水解。食品中的主要涩味来源——单宁能在单宁酶作用下生成中间产物1,2,3,4,6-pentagalloyglucose和2,3,4,6-tetragalloylglucose,并进一步催化分子中酯键的断裂,将其降解为没食子酸和葡萄糖。美国食品与药物管理局(FDA)已经认定单宁酶为安全产品。单宁酶是酶法制备抗菌剂甲氧苄氨嘧啶中间体没食子酸和食品添加剂没食子酸丙酯的催化用酶；作为添加剂也广泛应用于速溶茶、咖啡软饮料、啤酒和白酒等食品工业生产中,以解决因含单宁而引起的浑浊、涩味等品质问题；在皮革的生产过程中,单宁酶可作为工业鞣剂用于匀化生皮,同时固定化单宁酶还用于处理制革厂排放的含单宁的废水；在化妆品行业中,单宁酶也可用以解决因添加含单宁植物提取液而引起的浑浊或结块现象。目前,工业单宁酶存在的主要问题是酶活力低、热稳定性低,制约了单宁酶的工业化发展。本文从富含单宁的云南红茶中筛选得到一株高产耐高温胞外单宁酶菌株Aspergillus awamori FCYN206,优化了其发酵产酶条件,并对胞外单宁酶的酶学性质进行了研究,同时将Aspergillus awamori FCYN206应用于香蕉茎叶发酵饲料的制备。主要研究结果概括如下：1.筛选并鉴定了一株高产胞外单宁酶菌株。从云南红茶中筛选出3株产胞外单宁酶活力较高的菌株。产酶能力最高的菌株FCYN206(50.24U/mL)经菌种形态学判定为真菌,提取其基因组DNA,经18S rRNA测序鉴定,克隆得到的18S rRNA基因组大小为1333bp,所获序列在GenBank中进行同源性比对,显示与泡盛曲霉Aspergillus awamori strain PSFW1RH-1序列同源性为99%,根据该序列及菌落形态将菌株FCYN206鉴定为泡盛曲霉Aspergillus awamori,并在NCBI申请了新菌种序列,GenBank菌株序列号：JQ728449。2.通过响应面实验优化得到了Aspergillus awamori FCYN206的最佳产胞外单宁酶条件。首先通过单因素实验得到培养基中单宁浓度、额外添加碳源种类及添加量、氮源种类及添加量、初始pH值等因素对产酶的影响。然后利用软件Design-Expert8.05,采用Box-Behnkens设计响应面实验,建立Aspergillus awamori FCYN206液体摇瓶发酵产胞外单宁酶的二次多项数学模型,检验证明该模型是合理可靠的。单宁浓度、蔗糖浓度对胞外单宁酶活力影响显著,最优产酶条件为：单宁2.18%、蔗糖1.88%、NaNO30.12%、初始pH值4.01,在此条件下250mL三角瓶装培养液50mL,接种1mL孢子悬液(5×109个/mL),30-C、120rpm培养72h后,胞外单宁酶活力高达172.54U/mL,比优化前提高了3.43倍。3.对Aspergillus awamori FCYN206胞外单宁酶的稳定性进行了研究。发现该胞外单宁酶具有良好的储存稳定性,单宁酶在4℃恒温储存4周和12周后仍保存98.02%和90.49%的酶活力；耐高温性能优越,20～80℃水浴1h,酶活力保留率均在90%以上,90℃保温1h仍能保持88%的酶活,最适酶促反应温度为40℃；具有较广的pH稳定性,4℃、pH3.0-6.5储存24h,.酶活力保存率均在90%以上,最适酶促反应pH值5.5。4.研究了盐浓度对Aspergillus awamori FCYN206胞外单宁酶活力的影响。实验表明,当NaCl浓度小于1mmol/L时,菌株Aspergillus awamori FCYN206胞外单宁酶活力略有上升,而当NaCl浓度大于1mmol/L时,随着离子强度的增大,酶活力迅速下降,当NaCl浓度达到5mmol/L时,胞外单宁酶活力仅为原有酶活力的66.32%。5.研究了金属离子对Aspergillus awamori FCYN206胞外单宁酶活力的影响。在浓度为2mmol/L时,K+、Ag+、Zn2+等金属离子可促进酶促反应的进行,其中Ag+能提高酶活力26.35%,K+、Zn2+分别能提高酶活力2.34%、6.27%；而同等浓度的Na+、Mg2+, Ca2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+、Co2+、Mn2+、Cu2+、Ba2+均能在不同程度上抑制酶活力,其中Co2+、Cu2+对胞外单宁酶抑制性最强,分别抑制胞外单宁酶活力31.01%、35.04%。6.研究了醇类有机溶剂对Aspergillus awamori FCYN206胞外单宁酶活力的影响。实验表明,乙醇对该菌株胞外单宁酶活力无影响,1%(v/v)的甲醇、异戊醇、丙三醇、正丁醇均能促进该胞外单宁酶酶促反应的进行,异丙醇对胞外单宁酶活力影响最大,能提高胞外单宁酶活力12.16%。7.研究了表面活性剂和螯合剂对Aspergillus awamori FCYN206胞外单宁酶活力的影响。结果显示,吐温20、吐温80、Triton X-100、EDTA、SDS均能在不同程度上抑制胞外单宁酶酶促反应的进行,且随着时间的延长,对酶活力的抑制均具有不同程度的增强,其中吐温20对胞外单宁酶活力影响最大。添加0.2%(v/v)吐温20的酶液于30℃保温5min后,胞外单宁酶活力降为对照组的65.32%,1h后胞外单宁酶活力仅为43.23%。8.测算了以没食子酸丙酯(PG)为底物时,Aspergillus awamori FCYN206胞外单宁酶的Km值和Vmax值。pH5.0、30℃条件下,胞外单宁酶酶促反应的最适底物浓度为2.5mmol/L,以酶促反应速率对PG浓度做Linewear-Burk双倒数图,由此求得胞外单宁酶米氏常数Km为0.673mmol/L,最大反应速率底物浓度Vmax为0.065mmol/L·min。9.对Aspergillus awamori FCYN206、胞外单宁酶、乳酸菌、啤酒酵母、EM菌应用于香蕉茎叶发酵饲料品质改良实验进行了研究。结果表明：菌株Aspergillus awamori FCYN206、乳酸菌、啤酒酵母、EM菌、胞外单宁酶均能在不同程度上降解香蕉茎叶中的单宁。添加Aspergillus awamori FCYN206和胞外单宁酶的实验组发酵后,单宁含量降低30.19%,且香蕉茎叶饲料粗蛋白含量上升16.19%,说明添加该高产胞外单宁酶菌株发酵后,提高了饲料的营养价值。