一直以来,中枢神经损伤后的修复与再生都是神经科学领域研究的重点以及难点,导致其损伤后难以再生的原因包括两个方面:神经节细胞发生继发性凋亡以及新生轴突难以穿过损伤区[1-2]。其中轴突需要穿过胶质细胞活化聚集形成的胶质疤痕和损伤时所产生的抑制性微环境[3-4]。胶质瘢痕的形成虽然在一定程度上能够减轻急性炎症反应引起的的神经元毒害作用,但是它所形成的机械屏障阻碍了再生轴突穿过损伤区域,除了机械屏障,胶质瘢痕还能够产生一些抑制性因子损伤节细胞和再生轴突[5-6]。中枢神经系统损伤后的几天之内会引发一系列的细胞和分子由静止状态变为活化状态引起胶质瘢痕的形成的变化过程,在这些变化中所涉及的主要细胞类型包括星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质前体细胞,胶质瘢痕的最终结构主要是由星形胶质细胞构成,星形胶质细胞经过不断分裂和迁移到中枢神经系统的损伤区,最终填补空置的空间[7]。多个学者针对于导致中枢神经损伤后再生困难的两大主要原因进行了大量研究:外源性补充多种神经营养因子[8];运用多种物质干扰凋亡信号通路[9-10]用抗体或RNA干扰阻断髓鞘抑制作用;尝试移植外周神经[11];干细胞的修复[12]。这些方法都能在一定程度上维持节细胞的存活,但是却不能使再生轴突穿过损伤区形成功能性的连接。经过多年的研究,学者们一致认为需要寻找一种多靶点作用物质并且同时满足两个条件1.维持节细胞的存活而且能促进轴突的再生并使再生轴突穿过胶质瘢痕区2.建立正确的细胞轴突之间的功能性联系,才是治疗中枢神经修复和再生的理想物质。Fischer[13]等人在无意间发现晶状体和视神经同时损伤时,可成功促进RGCs存活和视神经轴突生长,并且其再生轴突可达到上丘,形成功能性突触联系,推测晶状体损伤后释放出一类神经保护性物质,并且这种物质的神经保护作用也正好符合以上两个必要条件。经分离检测该物质为α-晶体蛋白。晶体蛋白约占晶状体蛋白总量的90%,对维持晶状体透明和白内障发展起决定因素,其中α-晶体蛋白占蛋白总量的40%,属于小热休克蛋白(s HSP)的一员,作为分子伴侣和结构蛋白在细胞和组织中起支持保护作用。大量研究证实α-晶体蛋白不仅存在于晶状体中,也在大脑、心脏、肝脏等重要器官中被发现,并发挥着重要的保护作用[14],在视觉系统中,α-晶体蛋白参与调控多种视网膜相关疾病,包括视神经机械损伤、缺血损伤、老年性黄斑变性、葡萄膜炎、糖尿病视网膜病变等[15-16];参与调节炎症反应[17],参与Caspase-3抑制凋亡[18]。本实验小组在前期的研究中也证实了α-晶体蛋白不仅能够促进节细胞的存活和轴突的再生[19-20]同时也能抑制小胶质细胞的激活和炎性因子的释放[21]。这一发现肯定了α-晶体蛋白在保护视神经的积极作用,但它如何促进再生轴突穿过星形胶质细胞为主的胶质瘢痕这一屏障有待研究。我们推测α-晶体蛋白除了作用于RGCs起保护作用外也可能对视神经活化的星形胶质细胞有一定的抑制作用,从而促进了再生轴突穿过胶质瘢痕。本研究离体分离培养视神经星形胶质细胞,一方面用脂多糖刺激视神经星形胶质细胞模拟视神经损伤时急性炎性反应引起星形胶质细胞活化状态,观察α-晶体蛋白对活化视神经星形胶质细胞的增殖、视神经GFAP表达变化及分泌功能的影响,另一方面运用对视神经星形胶质细胞划痕刺激模拟视神经机械损伤时星形胶质细胞的物理活化,观察α-晶体蛋白对星形胶质细胞迁移和CSPGs表达和炎性因子分泌功能的影响,探索α-晶体蛋白是否通过作用于星形胶质细胞来促进损伤视神经轴突再生。本研究主要分为两个部分:1.α-晶体蛋白对脂多糖诱导的视神经星形胶质细胞增殖、活化及分泌功能的影响研究2.α-晶体蛋白对划痕实验中视神经星形胶质细胞迁移、活化及分泌功能的影响研究第一部分:α-晶体蛋白对脂多糖诱导的视神经星形胶质细胞增殖、活化及分泌功能的影响研究1、分离培养视神经星形胶质细胞并鉴定其纯度;2、利用CCK-8检测α-晶体蛋白对脂多糖(LPS)活化的视神经星形胶质细胞增殖能力的影响;3、运用免疫组化染色和Western blot(WB)免疫组化染色观察LPS诱导视神经星形胶质细胞后胶质纤维酸性糖蛋白(GFAP)的蛋白水平变化;4、运用ELISA检测α-晶体蛋白对LPS诱导视神经星形胶质细胞分泌IL-1β、TNF-α的浓度变化。第二部分:α-晶体蛋白对机械活化的视神经星形胶质细胞迁移、分泌功能的影响研究1、通过划痕实验观察α-晶体蛋白对活化的星形胶质细胞迁移功能的的影响;2、运用免疫组化染色观察观察用α-晶体蛋白对划痕实验中星形胶质细胞胶质纤维酸性糖蛋白(GFAP)和CSPGs变化;3、运用ELISA检测检测α-晶体蛋白对划痕实验中视神经星形胶质细胞分泌IL-1β、TNF-α的浓度变化结果:第一部分:α-晶体蛋白对脂多糖诱导的视神经星形胶质细胞增殖、活化及分泌功能的影响研究LPS刺激后,星形胶质细胞大量增殖,同时细胞突起延长,相邻间突起交错联系增多,胞体变大,GFAP的荧光强度和蛋白表达明显增强,给予α-晶体蛋白(10-4g/l)干预后,与LPS刺激组相比,α-晶体蛋白下调视神经星形胶质细胞的增殖,同时细胞免疫荧光提示GFAP的荧光强度明显减弱,WB提示GFAP的蛋白水平显著下降(p<0.01),α-晶体蛋白处理后,LPS活化的视神经星形胶质细胞上清液中TNF-α和IL-1β含量相比LPS刺激组存在显著差异(p<0.01)。第二部分:α-晶体蛋白对机械活化的视神经星形胶质细胞迁移、分泌功能的影响研究划痕后,划痕周边的星形胶质细胞受到活化,开始增殖和迁移,给予给予α-晶体蛋白(10-4g/l)干预后,相对迁移率在24h和48h较空白对照组都有明显减小(p<0.05),ICC观察到给予α-晶体蛋白后,划痕周围星形胶质细胞聚集成团细胞减少,其分泌的抑制性因子CSPGs的表达减弱。上清液中的TNF-α和IL-1β含量均低于空白对照组(p<0.05)。结论:我们分别用LPS刺激和划痕刺激模拟视神经损后微环境对星形胶质细胞化学刺激和机械刺激活化过程,发现α-晶体蛋白能有效抑制星形胶质细胞的活化和增殖,减少抑制性分子CSPGs分泌,同时能够抑制炎性因子TNF-α和IL-1β的分泌,证实α-晶体蛋白对视神经损伤后星形胶质细胞的活化有明确的抑制作用,这可能就是α-晶体蛋白能够促进视神经损伤后轴突再生通过胶质瘢痕的作用机制之一。