论文部分内容阅读
黄单胞菌(Xanthomonas spp.)是一类最为重要的植物病原细菌,开展植物黄单胞菌病害生物防治研究对于减少化学农药带来的环境毒害、促进农业可持续发展具有重要意义。本论文以水稻稻黄单胞菌(X.oryzaepv.oryzicola, Xoo)病害为主要防控对象,以本实验室前期得到的一株具有广谱抗菌活性的内生解淀粉芽孢杆菌菌株B014为生防资源,在获得该生防菌胞外抗稻黄单胞菌蛋白基础上,开展该抗菌蛋白的体外、体内抗水稻黄单胞菌病害研究。其研究内容与主要结果如下: 1.抗稻黄单胞菌热稳定蛋白的制备及其抗细菌谱测定:以对稻黄单胞菌XooX102生长抑制为活性引导,通过酸沉淀、醇抽提、煮沸去杂及葡聚糖凝胶柱层析等方法从菌株B014发酵上清中获得一个抗菌蛋白组分(命名为B014-HSP);经Tricine-SDS-PAGE电泳检测, B014-HSP抗菌蛋白主要由分子量为23kDa的蛋白质组成;琼脂扩散法检测其热稳定性,结果显示,60~121℃下处理30 min对该抗菌蛋白抗稻黄单胞菌活性无明显影响;琼脂扩散法测定其抗细菌谱,结果显示,该抗菌蛋白在6.25 mg/mL~50 mg/mL的测试浓度下,能抑制测试细菌无色杆菌(Photorhabdus luminescens)、聚团泛菌(Pantoea agglomerans)、考克氏菌(Kocuria sp.)、欧文氏菌(Erwiniac sp.)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonasaxonopodis)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、鞘氨醇假单胞菌(Sphingomonas sp.)、嗜麦芽假单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)生长,具有广谱的抗细菌活性,其生长抑制所需的最低浓度随测试细菌不同而异。 2.B014-HSP抗菌蛋白对稻黄单胞菌菌株X102的体外抗菌作用研究:微量液体稀释法测定该抗菌蛋白B014-HSP对稻黄单胞菌X102的最小抑菌浓度(MIC)为6.25 mg/mL,其最小杀菌浓度(MBC)为12.5 mg/mL,且在高于MBC浓度下,对稻黄单胞菌菌株X102具有溶菌效应;在亚抑菌浓度下,该抗菌蛋白能引起稻黄单胞菌X102形态异常,细胞膜通透性增加,运动性、胞外多糖产生、生物膜形成下降,同时也明显抑制其胞外淀粉酶活性,但对病菌胞外蛋白酶、纤维素酶活性无明显影响。 3.B014-HSP抗菌蛋白对水稻黄单胞菌病害的生物控制效应及其对水稻的系统抗性诱导研究。(1)人工接种稻黄单胞菌菌株X102于离体水稻叶片后,经B014-HSP抗菌蛋白处理,其叶片发病率及病斑面积显著降低(p<0.01);(2)盆栽水稻幼苗人工接种稻黄单胞菌菌株X102后,经B014-HSP抗菌蛋白处理,叶片发病率、病斑面积、植株倒伏率显著降低(p<0.01);(3)采用RT-PCR方法检测B014-HSP抗菌蛋白对水稻抗性相关基因表达的影响,结果显示,B014-HSP处理可诱导病菌XooX102感染水稻幼苗NPR1基因(病程相关基因非表达子1基因)提前高量表达且持续上调以及PAL基因(苯丙氨酸脱氨酶基因)在病菌XooX102感染或未感染水稻幼苗持续上调;此外,B014-HSP抗菌蛋白处理可抵消水稻幼苗因病菌Xoo X102感染而导致的YUCCA基因(类黄素单加氧酶基因)表达抑制并抑制NCED3基因(9—顺环氧类胡萝卜素双氧加酶基因)的上调。(4)检测B014-HSP抗菌蛋白对水稻抗氧化酶活性的影响,结果表明,B014-HSP抗菌蛋白可以诱导水稻幼苗POD和SOD的活性升高得更快、更高。 4.B014-HSP抗菌蛋白注射烟草叶片可在3h内引起典型的防御性过敏反应(HR)。