论文部分内容阅读
本实验研究目的是通过构建结核菌ESAT-6蛋白免疫优势肽段P1的重组多肽表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达，并对表达产物进行纯化和复性，以获得大量ESAT-6P1抗原，同时对重组多肽免疫反应性进行鉴定评价，为探索重组多肽在结核病血清学诊断的应用奠定前期实验基础。
根据结核菌编码ESAT-6P1肽段的基因系列，通过PrimerPremier5.0引物设计软件，分析设计了1对特异引物，通过PCR技术从结核菌H37Rv基因组DNA扩增出ESAT-6P1蛋白基因片段，目的片段克隆到原核表达载体pET-30a中，成功构建N端带有6His-tag的融合表达载体。利用化学转化法将重组表达载体转化E.coliBL21(DE3)，PCR检测获得阳性的工程菌株；经IPTG诱导和SDS-PAGE分析，本试验成功获得了能够表达目的重组多肽的工程菌株。经梯度实验确定了工程菌发酵最适温度为37℃，诱导3小时后，可达到最大表达量，诱导剂IPTG最适诱导浓度为0.5mmol/L。表达方式分析发现该重组多肽在大肠杆菌中主要以包涵体的形式存在，并利用亲和层析方法对重组多肽进行了纯化。斑点免疫结合法(DIBA)结果说明重组ESAT-6P1肽段可被结核病病人血清特异识别。
血清学诊断是结核病早期、快速诊断方法中的一种，联合使用重组纯化的特异性蛋白抗原可以改善这种方法检测结核病人的敏感性和特异性。38kD蛋白也是一种结核菌的特异性蛋白，本研究还将重组的ESAT-6P1多肽与38kD蛋白组成联合抗原进行ELISA实验，结果显示检测结核病人血清抗结核抗体的敏感性为81.5％，检测健康查体者对照血清特异性为84.4％，表明联合抗原可用于结核病的免疫学诊断试剂的开发。