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地龙,又名蚯蚓,最早载于经典著作《神农本草经》中,是我国重要的动物药之一。地龙中含有多种有效成分,如蛋白质、肽类、氨基酸、核苷酸、脂类、微量元素等[1]。其中蛋白质含量高达70%以上,是其活性物质的重要组成部分。现代医学研究发现地龙除了具有清热定惊,痛经活络、平喘利尿等传统药效外,还具有抗血栓,降压平喘,抗辐射、增强免疫,抗癌抗肿瘤等功效。 姬松茸,又名巴西蘑菇,是一种药食同源且价格昂贵的真菌。其香气馥郁、鲜美可口,并含有糖类、蛋白质、维生素以及矿质营养元素等多种物质。1992年,中国从日本引进姬松茸并进行栽培。姬松茸多糖是其药用功效的主要生物学活性物质[1]。研究发现,姬松茸多糖具有降血糖、抗肿瘤、抗辐射、抗突变及抗炎等多种生物学活性。 本文以地龙蛋白和松茸多糖为研究对象,对其抗氧化,抗辐射损伤进行了研究。首次运用仿生酶解技术将地龙蛋白酶解成小分子的寡肽和氨基酸。以三氯乙酸沉淀法结合双缩脲比色法测寡肽含量为指标,优化了地龙蛋白的酶解工艺。基于对仿生酶单因素考察的结果,设计正交实验,最终确定了地龙蛋白的最佳酶解工艺:在pH值为2.01时[36],胃蛋白酶与底物浓度比1.5%,酶解时间5小时,加热使酶灭活后,调至pH值为8.0,胰蛋白酶与底物浓度比2%,酶解时间1小时。并对此工艺进行了寡肽含量测定,测得寡肽含量为75.66%。经过超滤膜截留对地龙酶解肽进行粗分离,分为>10 kDa酶解肽、3-10KDa酶解肽、1-3KDa酶解肽和<1 kDa酶解肽三部分。以羟基自由基清除率,RAW264.7细胞增殖率和B16小鼠黑色素瘤细胞增殖抑制率为指标筛选出活性最佳的酶解寡肽,运用独立性系数法对三种活性实验结果进行综合加权评分得出活性最佳的是<1 kDa地龙酶解肽。将筛选出的最佳酶解肽经固相萃取分离纯化,所得物质运用液质联用(LC-MS)技术分析。分析出2个寡肽,M=230(NH2-Asn-Pro-COOH)、M=279(NH2-Glu-Met-COOH)。将<1 kDa的地龙酶解肽(L)与松茸多糖(P)按照基线等比增减法进行配伍得到五种不同配伍比例的药对,即LP(2∶1)、LP(1.5∶1)、LP(1∶1)、LP(1∶1.5)和LP(1∶2)。以羟基自由基清除率活性,RAW264.7细胞增殖率活性和B16小鼠黑色素瘤抑制率活性为指标筛选出活性最佳的药对,运用独立性系数法对三种活性实验结果进行综合加权评分得出当<1 kDa的地龙酶解肽和松茸多糖质量浓度比为1∶1.5时,活性最强。 实验结果显示,五组不同配比的药对均具有抗氧化,抗辐射,提高机体免疫力的作用。但其中地龙—松茸药对比例为1∶1.5时抗氧化活性,抗辐射损伤及增强机体免疫力作用效果强于其他组,且优于单味药材组。 辐射损伤是由电离辐射所致的急性,迟发型或慢性的机体组织损害,辐射作用于生物体初期与自由基的生成,免疫细胞的损伤有关并且紫外线的长期照射会引起机体黑色素沉积。本文以羟基自由基抗氧化活性、RAW264.7细胞增殖率活性和B16小鼠黑色素瘤细胞增殖抑制率活性为指标对地龙-多糖药对的抗辐射作用进行研究,表明药对具有很好的抗辐射作用,且效果优于单味药材。故对地龙-多糖药对进行深入研究,将地龙酶解肽与多糖类成分结合,进一步研制疗效好,成本低的抗辐射损伤新制剂以满足市场需求,使其临床应用更合理,更有效。