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【研究目的】1、利用胰蛋白酶-EDTA消化液分离纯化原代培养的汗腺细胞,为下一步诱导实验做准备;2、筛选人骨髓间充质干细胞和汗腺样细胞之间差异表达的microRNAs,并利用生物信息学进行差异表达microRNAs的靶基因预测,寻找人骨髓间充质干细胞向汗腺样细胞分化的关键调控microRNAs,并初步预测其功能;3、探索microRNAs在人骨髓间充质干细胞向汗腺样细胞分化中的作用。【研究方法】1、采用II型胶原酶溶液消化皮肤并分离出汗腺细胞团;2、采用胰蛋白酶-EDTA消化液分离纯化原代培养的汗腺细胞,并进行免疫组化鉴定培养的细胞,同时进行皮肤HE染色观察正常人皮肤中的汗腺形态结构;3、对成骨细胞、成脂肪细胞诱导分化液诱导后的人骨髓间充质干细胞分别进行茜素红、油红O染色,鉴定人骨髓间充质干细胞的多向分化能力。采用Transwell培养板构建人骨髓间充质干细胞和热休克汗腺细胞间接共培养诱导分化模型,并利用免疫荧光、RT-PCR和Western Blot技术对诱导后的人骨髓间充质干细胞进行汗腺细胞表面标志物的检测;4、提取人骨髓间充质干细胞和汗腺样细胞的总RNA并作纯化标记,然后进行microRNAs芯片杂交并利用生物信息学进行靶基因预测,采用实时荧光定量PCR进行芯片结果的验证,初步确定汗腺发育有关的microRNAs;5、将化学合成的特定的microRNAs mimics、microRNAs inhibitor、microRNA Negative Control分别转染人骨髓间充质干细胞并继续与热休克的汗腺细胞间接共培养诱导7天,之后采用免疫荧光、RT-PCR和Western Blot技术检测特定microRNAs mimics、microRNAs inhibitor、microRNA Negative Control转染后并间接共培养诱导的效果。【研究结果】1、经胰酶-EDTA消化液分离纯化后,去除了新生汗腺细胞周围95%以上的成纤维细胞,得到了高纯度的原代培养的汗腺细胞。2、人骨髓间充质干细胞诱导后汗腺细胞表面标志物cea、ck8、ck19表达阳性。3、经过对micrornas芯片结果对比分析,人骨髓间充质干细胞和其诱导分化来源的汗腺样细胞之间micrornas表达水平绝对值相差2倍以上的micrornas有68个,其中上调的有19个,下调的有49个。表达水平上调相差5倍以上的micrornas有microrna-132-3p、microrna-4467、microrna-4484、microrna-146a-5p、microrna-6126等5个。表达水平下调相差5倍以上的micrornas有microrna-708-5p、microrna-138-5p、microrna-6812-5p、microrna-138-1-3p、microrna-1281、microrna-3157-3p、microrna-4298、microrna-4459等8个。4、实时荧光定量pcr检测结果与micrornas芯片结果一致。5、生物信息学靶基因预测分析显示:在这些差异表达的68个micrornas中,有18个micrornas靶向于已知的汗腺生长发育相关的nf-κb信号通路、mapk/erk信号通路、wnt/β-catenin信号通路和eda/edar信号通路中的多个基因。且microrna-138-1-3p改变明显并与汗腺发育eda/edar信号通路中的eda基因有关。6、microrna-138-1-3pmimics转染间接共培养组较micrornanegativecontrol转染间接共培养组的eda基因表达减弱,形成的cea、ck19阳性细胞数量较少;microrna-138-1-3pinhibitor转染间接共培养组较micrornanegativecontrol转染间接共培养组的eda基因表达增强,形成的cea、ck19阳性细胞数量较多。【研究结论】1、经过胰酶-edta消化液差速消化法得到了高纯度的原代培养的汗腺细胞;2、通过间接共培养诱导分化模型,能够诱导人骨髓间充质干细胞向汗腺样细胞分化;3、人骨髓间充质干细胞和其诱导分化来源的汗腺样细胞之间有68个差异表达的micrornas,这些差异表达的micrornas可能在人骨髓间充质干细胞向汗腺样细胞分化过程中起作用;4、microrna-138-1-3p作用于eda/edar信号通路中的eda基因参与调控人骨髓间充质干细胞向汗腺样细胞分化。